上科大团队绘出世界首张小鼠“扰动图谱”,其突破性基因解码技术将影响众多领域

上科大团队绘出世界首张小鼠“扰动图谱”,其突破性基因解码技术将影响众多领域
2022年08月15日 17:58 麻省理工科技评论

8 年,磨成一剑。

2014 年,池天教授还在耶鲁大学工作时,萌生了关于诱导性干扰马赛克动物(iMAP,Inducible Mosaic animal for perturbation)的想法,但因为过于新颖几乎没人看好。

2015 年底,在加盟上海科技大学生命科学与技术学院后(目前仍担任耶鲁大学客座教授),池天“冒险”地继续了这个让他意难平的课题。上科大也支持他坐冷板凳,最终于 2022 年将论文发在 Cell 上。

▲图 | 池天(来源:池天)

据悉,此前一直缺乏在动物体内高效解码基因功能的技术。而池天团队研发的 iMAP 能将解码速度提高 100 倍,从而填补了这一空白,可助力突破功能基因组学领域的困境。

另外,课题组还首次明确提出“扰动图谱”的概念,并利用 iMAP 描绘了 90 个基因在 39 种组织里的关于基本功能的扰动图谱,这在全球范围内是第一张。该工作在技术和概念上为描绘完整的扰动图谱奠定了基础。

上科大和池天将推动成立 iMAP 研究中心以及相关的生物科技公司,并联合该校临床医学中心,以充分开展后续工作。

(来源:Cell)

据介绍,iMAP 有广阔的应用前景。

其一是描绘“全基因组、泛组织、单细胞水平的扰动图谱”,解码小鼠所有基因,从而极大地推动基因研究。预计这将是一个规模宏大的国际合作项目。

其二是发现疾病治疗靶点。目前有很多疾病无法治疗,一个关键原因是人们对治疗靶点缺乏了解。有些疾病已有靶点,但未必是最佳靶点。而利用 iMAP 能够“破天荒”地在小鼠疾病模型里,大规模地筛选优质靶点。

其三是发现药物的新适应症即老药新用,这能有效缩短漫长、昂贵、痛苦的新药研发历程。

其四是以廉价成本制备单基因敲除品系。一个 iMAP 品系可通过简单的繁殖,衍生出上百种传统的单基因敲除品系,从而大大降低制备成本。

其五,iMAP 建筑于重组酶技术(Cre-LoxP,Cyclization Recombination Enzyme-locus of X(cross)-over in P1)和 CRISPR-Cas9 基因编辑技术之上。目前已知的是,这两大技术能适合各种多细胞模式生物。因此,理论上 iMAP 也可推广到这些生物。眼下已有植物专家和线虫专家,准备运用 iMAP 改良水稻品种和研究线虫基因功能。

(来源:Cell)
解决功能基因组学领域的瓶颈难题

人体有 2 万多个基因,500 多种细胞。虽然人类在 20 多年前就已知道这些基因序列,但是基因在各种细胞中的功能至今鲜为人知,这已成为疾病诊治的痛点。

要想高效突破这一困境,则需利用高通量技术、在模式动物比如小鼠中,将这些基因分别在各种细胞里进行敲除也就是扰动,然后再鉴定基因敲除直接导致的细胞表型,也即描绘“扰动图谱”。

然而,当下的各种基因敲除技术,各有各的严重局限性,无法有效地描绘扰动图谱,这是造成上述困境的关键原因。

例如,在传统的小鼠基因打靶技术里,每次只能敲除一个基因,不仅通量低、而且由于基因敲除发生在小鼠全身、或特定组织的全部细胞,这种打靶方式往往会导致严重的全身性症状。这时,那些基因敲除所导致的直接细胞表型,就会被遮盖和混淆。

科学界并非没有尝试寻找解决办法。比如,基于向导 RNA 病毒文库的 CRISPR 体内原位基因筛选,能同时在小鼠敲除多个基因,而每个细胞只敲除一个。故此一个特定基因只能在细胞群中的一小部分细胞被敲除,从而避免影响组织器官的整体功能。

尽管该方法克服了传统小鼠基因打靶技术的两大局限性,但不幸的是其本身也有严重缺点,包括难以有效地递送 gRNA 文库到体内细胞、病毒文库无法重复利用等。而此次成果则解决了这一痛点。

值得一提的是,此次报道的雏形扰动图谱已给学界提供了大量用常规方法难以轻易获得的、有实用价值的信息。例如,扰动图谱显示一个叫 Hdac7 的基因强烈地抑制 CD8 T 细胞的功能,提示 Hdac7 是肿瘤免疫疗法的治疗靶点。当池天团队将该基因的同源基因从人 CAR-T 细胞敲除,发现确能明显提高其抗瘤活性,这证明 iMAP 可用于筛选疾病的治疗靶点。

总之,本工作既作出了有价值的发现,也为后续的重大发现铺平了道路。

近日,相关论文以《整个生物体中的大规模多路复用镶嵌 CRISPR 扰动》(Large-scale multiplexed mosaic CRISPR perturbation in the whole organism)为题发表在 Cell 上 [1],刘波、荆征宇、张校铭、陈玉鑫、毛少帅担任共同第一作者,池天担任通讯作者。

图 | 相关论文(来源:Cell

池天表示:“审稿过程非常顺利,只补了一个小实验。三个审稿人都非常 positive,有的说‘truly love Perturb-Atlas’, 有的认为 iMAP 是‘unquestionable leap’和‘powerful technology’。其中一位审稿人看得出奇得认真,简直连标点符号都不放过,并提出大量意见,但都是建设性的,例如建议我们提供详细的实验步骤描述以利于同行重复等。”

有趣的是,论文第一稿有这样一句话“本课题是 8 年工作的结晶”。后来课题组把它删了,因为一位审稿人说这不足挂齿,很多课题都如此。二审后,论文被正式接收。

池天的耶鲁同事、一个著名免疫学家在贺信中表示,iMAP “将对众多领域发生变革性影响”。Cell 编辑也认为 iMAP 是“变革性技术进展”。编辑部原先计划请专家为 iMAP 写亮点介绍(Preview),后来由于时间冲突,决定于 2022 年 11 月发表有关长篇综述。”

(来源:Cell)

研发 iMAP 的八年“抗战”

如前文所述,池天于 2014 年萌生了此次研究想法。当年,麻省理工学院(MIT)麦戈文脑研究所教授张锋、北京大学生命科学学院教授魏文胜等,报道了体外高通量 CRISPR 基因筛选技术。

但如前所述,由于病毒文库的递送问题,这种技术难以用到体内。于是池天想到将多种向导 RNA 串联在一起,再将其作为转基因引入小鼠,进而制备新型品系。

这样,小鼠全身每个细胞就天然地携有转基因。转基因中蕴藏的向导 RNA 平常是不能表达的,但利用 Cre-LoxP 应该就能释放出来,并且每个细胞随机释放一个基因并进行敲除。如此,就从根本上解决了文库递送的难题。

另外,由于生殖细胞也携带这个文库,当敲除了相应的靶基因,一个小鼠就应该能繁育出很多不同的单基因敲除品系,从而大大降低后者的制备成本。

池天说,这些想法并不是某天灵光一闪,一下子全部想到的,而是在几个礼拜里通过阅读文献、演算 Cre-LoxP 重组概率等慢慢成熟的。但起初无法立项课题的主要缘由,实在是因为风险太大。 不过研究仍然启动了。

此后便进入第二阶段,期间屡败屡战、蹒跚前行。课题组踩了很多坑,有些坑甚至很“诡异”。例如,将携带 U6 启动子的转基因插入基因组的“安全港”里,启动子竟然被沉默;此外,在该团队的体系里,一种 LoxP 突变体和 CreER 融合蛋白,其行为都和此前文献所报道的大相径庭。

每次失败,都浪费半年以上的时间。但探索过程中也有意外的惊喜。例如,该团队发现由多个向导 RNA 表达单位构成的转基因,其结构非常稳定,尽管这类重复序列一般难以稳定遗传。而如果利用 PiggyBac 转坐子将转基因随机插入基因组,U6 启动子一般不会被沉默(刻意插入安全港则相反)。

这些失败的实验和成功经验,部分已被整理成论文,并已于 2020 年以预印本论文形式发表。

“上述阶段始于 2014 年 7 月份,终结于 2020 年 7 月,正好 6 年,其中 4.5 年在上科大。2020 年是转折点,当时我们鉴定了靶向 6 个 marker gene 的品系,发现其表现非常漂亮。此后我们乘胜追击,利用 iMAP 鉴定了 90 个基因在 39 种组织的功能,并用自主研发的软件,分析了大量数据,直到今年 7 月论文发表,整个课题正好持续 8 年。”池天回顾称。

(来源:Cell)

“放在耶鲁也是学霸”

重复序列有两个特性:结构不稳定,易被沉默。这两者只要有一样发生在 iMAP 转基因上,实验就必然失败。但是池天喜欢冒险,不为所动,毅然决定正式启动此次课题。

即便步履维艰,他也没有放弃,这离不开上科大的支持,学校是鼓励坐冷板凳的。而他在耶鲁也启动了数个像 iMAP 一样高风险高难度的项目,后来都因经费问题半途而废。

他继续说道,上科大学生也很能干。例如,在此次论文的作者中:刘波心思慎密;荆征宇自学生物信息学,自编各种程序分析了所有 iMAP 高通量测序数据,而由于 iMAP 文库与常规的病毒文库不同,因此他必须原创分析方法;“鬼手”毛少帅动手能力超强;张校铭、陈玉鑫也各有特长。这些学生齐心协力,前赴后继、非常给力,有几个放在耶鲁也会是学霸。

“其中,没有博后经历的刘波,已受聘任中国科技大学研究员、博士生导师,通常这些职位是为有博士后训练的人提供的。”池天表示。

“还有一件事要分享。两年前我们将 iMAP 的原理和早期实验结果以预印本形式发在 BioRxiv 上,但发表前没有申请专利,因为误认为预印本不影响专利申请。提醒大家不要犯这个错误。好在后来对 iMAP 做了重大改进,这些改进有新颖性,因此已经申请了相关专利。”他补充说。

下一步的计划有很多。第一是优化 iMAP 技术,克服其局限性,例如通量较小(一次靶向 100 个基因),也还不够灵敏(需要 10 万个细胞)、在有丝分裂后细胞上的编辑效率偏低(这是 Cas9 本身的问题)。

第二,拓展 iMAP 以便让其不仅能敲除靶基因,还能以沉默、敲低、激活等扰动方式来干预靶基因,从而带来更多独特用途。例如,利用 iMAP 敲低 RNA, 很适合研究长非编 RNA (LncRNA) 的功能。这类 RNA 数量庞大,但似乎大多没有重要功能,如果通过逐一敲除加以排查,则将事倍功半。此前池天曾用传统方式敲除 8 个 LncRNA,结果 8 个小鼠品系全无表型,无功而返。而利用 iMAP 对 100 条 LncRNA 进行快速原位筛选,则能避免这种悲剧的发生。

第三和第四个计划,分别是启动、实施国际扰动图谱计划,以及利用 iMAP 筛选疾病治疗靶点和老药新用途。

第五,课题组将制备靶向整个基因组 iMAP 品系及其衍生品系, 以提供给学界。以目前的通量即每品系打靶 100 个基因来看,200 个品系足以覆盖全基因组。至于其衍生的 2 万个品系,可以用冻存精子的形式,进行便捷性的维持和分享。

参考资料:

1.Liu, B., Jing, Z., Zhang, X., Chen, Y., Mao, S., Kaundal, R., ... & Chi, T. (2022). Large-scale multiplexed mosaic CRISPR perturbation in the whole organism. Cell.

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