2012 年 6 月，《科学》上发布了一项重磅研究，该研究第一次将天然 CRISPR 系统（一种 RNA 引导的 DNA 核酸内切酶）定位为基因编辑工具。Emmanuelle Charpentier 博士和 Jennifer Doudna 博士也因此获颁 2020 年诺贝尔化学奖。
至今，CRISPR 作为基因编辑工具已有十年时间。自问世以来，它被持续改进以用于解决越来越多的问题。
医学领域发展出了一系列 CRISPR 疗法，其中少数已进入临床试验的早期阶段，包括治疗镰状细胞性贫血、艾滋病和急性髓性白血病的疗法。去年，一种基因编辑的同种异体嵌合抗原受体 T 细胞疗法获得了 FDA 的再生医学高级疗法（RMAT）认定，用于治疗复发或难治性 CD19 阳性 B 细胞恶性肿瘤。
可编程的基因插入
大片段 DNA 插入和多路复用基因组整合仍然是基因组编辑未解决的难题。目前的基因整合方法需要双链断裂来刺激 DNA 损伤反应。此外，基于 CRISPR 的绕过双链断裂的方法，如质粒编辑，仅限于修改或插入短序列。
2021 年底，由张锋博士领导的麻省理工学院实验室的两名校友，Jonathan S. Gootenberg 博士和 Omar O. Abudayyeh 博士，介绍了他们最新的 CRISPR 系统——PASTE（通过特定位点靶向元件的可编程添加）。
这项技术通过用融合了逆转录酶和丝氨酸整合酶的 CRISPR-Cas9 缺口酶指导插入，在不同的基因位点实现了高效和多功能的基因整合。在不产生双链断裂的情况下，PASTE 可以在人类细胞系、原始细胞和静止的非分裂原始人类细胞的多个基因组位点整合大至约 36 kb 的序列，整合率在 10% 至 50% 之间。
“PASTE 技术实现了可编程的基因插入，并且能够将大片段插入任意位置基因组中”，Gootenberg 说。我们可以以任何想要的方式编辑基因组。”
▲图丨Jonathan S. Gootenberg 博士（来源：GEN）可编程基因插入的最佳应用之一是治疗。“有一些公司正在使用先进的 CRISPR 方法，进行单核苷酸或小型编辑”，Gootenberg 说。他还指出，这些方法很吸引人，但是可能对有许多突变的基因不起作用。
“例如，囊性纤维化跨膜电导调节因子基因有大约 1800 种不同的突变。你不会为囊性纤维化开发 1800 种不同的药物。因此，与其采用这种方法，不如用一个健康的基因完全替换该基因。那样的话你甚至不需要知道病人有什么突变。”Gootenberg 说。
细胞类型特异性递送
根据 Gootenberg 和 Abudayyeh 等人的说法，实现 CRISPR 全部潜力的最大挑战可以说是改进体内递送。
“我们需要能够精确地靶向更多的细胞和组织类型，这对于开发负担得起且可获得的疗法很重要。”
▲图丨Omar O. Abudayyeh 博士（来源：GEN）对于需要全身使用 CRISPR-Cas9 系统的疾病，细胞类型特异性递送是避免递送介导的脱靶效应的理想选择。尽管病毒和纳米颗粒递送系统效果良好，尤其是在递送至肝脏方面，但在其他细胞或组织方面还有很多工作要做，特别是要提高选择性。
使用非病毒载体实现细胞类型特异性基因递送的努力包括用各种靶向分子进行表面修饰，例如小分子配体、肽和抗体。一种途径是使用适配体，即单链寡核苷酸，折叠成确定的结构并与蛋白质等目标结合。
Spotlight Therapeutics 公司正在通过其靶向活性基因编辑（TAGE）平台开发工程核糖核酸蛋白，以解决目前体内递送系统的多种限制。这些核糖核酸蛋白是通过将跨膜运输部分（细胞穿透肽）和细胞靶向部分（配体或抗体）与 CRISPR 核酸酶结合而产生的。
▲图丨Spotlight Therapeutics 通过使用其靶向活性基因编辑器 (TAGE) 平台开发细胞靶向体内 CRISPR 基因编辑生物制剂（来源：官网）
“我们采取了一种生物学方法，架构借鉴了利用抗体药物偶联物将有效载荷递送至特定细胞的成功经验”，Spotlight 公司总裁兼首席执行官 Mary Haak-Frendscho 博士说。“我们正在使用抗体或抗体衍生物将核酸酶效应子（Cas9 或 Cas12）递送到已经装载了引导物的特定细胞。”
这些生物制剂的半衰期很短，在所需的基因编辑事件之后不会在体内持续存在。这减少了脱靶裂解事件的风险，最大限度地减少了抗药性免疫反应的可能性，并允许更大的剂量灵活性。
基因沉默/激活
表观基因组是基因表达的天然看门人，它由标记物组成，这些标记物通过高度保守的机制被添加或删除，以确定每个细胞的身份和功能。通过对表观基因组的定向调控，可以在不切割或破坏 DNA 的情况下调整基因表达，从而避免使用基因编辑可能带来的一些损害。
根据表观遗传药物开发商 Chroma Medicine 的首席执行官、医学博士 Catherine Stehman-Breen 的说法，通过基因编辑进行遗传调节就像通过撞上灯柱来停车一样。“喇叭响了，挡风玻璃碎了，车也停了。如果你只使用刹车，受到的伤害会少得多。这就是我对表观遗传学的看法。”
▲图丨Catherine Stehman-Breen（来源：genengnews）Chroma Medicine 公司正在提供一个模块化的、灵活的、基于 CRISPR 的平台，以开发基于基因沉默或激活的表观遗传药物。
▲图丨Chroma Medicine 开发了针对基因和控制染色质构象的可编程表观遗传编辑器（来源：官网）该平台将 DNA 结合域与表观遗传效应域耦合。DNA 结合域特异性靶向要沉默或激活的基因（或多个基因）。效应域产生特定的甲基化模式，控制染色质构象，并控制基因是否可用于转录。在简单的应用中，可以靶向单个基因。在更复杂的应用中，可以同时靶向多个基因。甚至有可能一些基因被沉默，而其他基因被激活。
Stehman-Breen 说，Chroma 公司的平台所提供的复杂的多路复用可以用在很多方面。例如，这些工具可以用于细胞治疗，在这种情况下，使用基因编辑进行复杂的多路复用可能并不理想，介于转座等因素。
“有了表观遗传学的调控，您可以根据需要操纵任意数量的基因，而不会导致 DNA 的任何切割或混合。”
微生物组的调控
CRISPR 使用的一个增长趋势与微生物组有关。CRISPR 被包装成噬菌体，用于影响细菌，这与 CRISPR 系统在自然界的存在方式相反——细菌利用 CRISPR 来对抗噬菌体。CRISPR 技术有可能实现对微生物群落前所未有的控制。例如，可以在不针对有益细菌的情况下消除耐药细菌。这种控制对于解决抗生素耐药性至关重要。
杀死选定的细菌种群只是对微生物组进行控制的一种方式。另一种方式是对细菌进行基因改造，使其表达治疗性蛋白质和肽。第二种控制形式提出了劫持细菌以调控关键过程的前景，如代谢和免疫过程。
丹麦公司 Snipr Biome 正在探索这两种微生物组控制方法，该公司开发了一种名为 CRISPR-Guided Vectors 的专有技术。Snipr Biome 公司的联合创始人兼首席执行官 Christian Grøndahl 博士说：“我们可以通过插入表达蛋白质、抗体、酶或小激素的基因来调控微生物组，以达到治疗的效果。”他补充说，公司的技术可用于调节微生物组和治疗 2 型糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝和肠易激综合征等疾病。
▲图丨SNIPR Biome 使用工程噬菌体或细菌将 CRISPR 引导载体 (CGV) 递送至细菌宿主（来源：官网）“我们可以通过插入表达蛋白质、抗体、酶或小激素的基因来调节微生物组，以达到治疗效果”，Snipr Biome 的联合创始人兼首席执行官 Christian Grøndahl 博士说。他补充说，该公司的技术可用于调节微生物组和治疗 2 型糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝和肠易激综合征等疾病。
在进行慢性和活体治疗时，安全性是一个大问题。Grøndahl 指出，“如果你引入一个基因，你还必须能够控制它，并在获得治疗效果或想要降低产出时将其关闭。” 为此，Snipr Biome 正在使用其技术安装“安全开关”，允许插入的基因被切除，这是完全收获微生物组的更好的选择。
未来 10 年的 CRISPR
未来 10 年，我们可能会看到越来越多的基于 CRISPR 的诊断和批准的药物。甚至可能看到人们安全有效地治疗过去认为永远无法治愈的遗传疾病。人们将能够先发制人地改变个人的健康状况。
按照这些思路，研究人员认为未来十年，CRISPR 的用途将不是用于治疗而是预防。
“人们非常关注 CRISPR 在治疗特定疾病方面的潜力，未来几年，我们将逐渐看到其在预防疾病方面的新应用。目前，CRISPR 已被用作诊断工具。我们也可以编辑使人们易患疾病的基因，包括衰老疾病。”
除了在医疗保健领域的应用，研究人员认为 CRISPR 在农业和气候领域的应用将对世界产生更显著的影响。
现在已经出现 CRISPR 编辑的农产品，未来几年，将看到 CRISPR 解决粮食安全、干旱和洪水耐受性、减少农药和化肥使用、消除农业排放以及碳去除和封存等更多问题。
未来有很多不确定性，我们可以确定的是，CRISPR 会在塑造个人和地球方面发挥重要作用。
参考资料：
1.https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/crispr-technology-turns-10-rises-to-new-challenges/
