纤毛是基于微管和膜包裹的真核细胞突起，在细胞运动、流体流动生成、感官知觉和细胞间信号传导中发挥重要作用。纤毛的生长是一个快速的过程：单细胞藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 可以在 90 分钟内长出 12μm 长的纤毛。
在此期间，构建轴丝的数百种不同蛋白质，需要通过称为鞭毛内转运（IFT，intraflagellar transport） 的主动转运机制穿梭到纤毛中。在纤毛稳态中，鞭毛内转运从纤毛中去除不需要的蛋白质并通过在纤毛内外运输膜蛋白（包括 G 蛋白偶联受体和离子通道）来调节依赖于纤毛的信号转导通路。
因此，鞭毛内转运对于纤毛正常发挥功能至关重要。鞭毛内转运中的缺陷会损害纤毛组装和纤毛信号传导，导致一系列称为纤毛病的疾病，包括骨骼纤毛病、多囊肾病、视网膜退行性疾病和巴德-比德尔综合征等。
尽管人们在 30 年前就发现了鞭毛内转运，但学界仍然不完全了解这种单一机制如何在两个不同的方向上，选择性地运输如此多的不同货物。
鞭毛内转运依赖于称为 IFT train 的马达蛋白驱动的大蛋白质复合物（多兆道尔顿）穿梭机。IFT train 由高度保守的鞭毛内转运-A 和鞭毛内转运-B 复合体的重复单元组装而成，并装饰有适配器蛋白，可以扩展鞭毛内转运列车可以运输的货物数量和类型。
顺行 IFT train 由马达蛋白 kinisen-2 提供动力，但也装载动力蛋白 dynein-2，后者为逆行运输提供动力。除了它们的不同组成外，顺行和逆行列车还沿着构成轴丝的双微管内的不同小管行进，这可以防止沿相反方向移动的列车之间发生碰撞。
此前，学界在单个鞭毛内转运蛋白的结构和相互作用上取得了一定的进展。16 个鞭毛内转运-B 亚基中的 11 个的晶体结构已被解析或部分解析，而电子显微镜已用于最大的鞭毛内转运-B 亚基鞭毛内转运 172 成像。
晶体学也被用于可视化鞭毛内转运-B 中发生的一些蛋白质-蛋白质相互作用，包括鞭毛内转运 25 和鞭毛内转运 27 之间的相互作用、鞭毛内转运 52 与鞭毛内转运 46 和鞭毛内转运 70 的关联，以及三聚体鞭毛内转运 22/74/81 复合物。
然而，鞭毛内转运-A 的 6 个亚基的结构信息完全缺失。酵母双杂交分析、免疫共沉淀、可见免疫沉淀以及遗传相互作用分析等方法，已被用于生成鞭毛内转运亚基之间的相互作用网络。
但是，这些方法无法提供鞭毛内转运外观和功能的全貌。除了这些方法之外，低温电子断层扫描（cryo-ET） 已经在原位揭示了 IFT train 的结构，但由于这种方法缺乏分辨率，因此无法确定鞭毛内转运蛋白各个亚基在复合物中的位置，并且越来越多的证据支持鞭毛内转运蛋白在囊泡运输中的额外作用。
同时，鞭毛内转运-A 复合物亚基的组成形式，鞭毛内转运-A 如何结合囊泡、聚合成 IFT train 以及在这些状态之间的转换，都是对鞭毛内转运转运机制的理解具有重要意义，有待解决的根本性问题。
为此，哈佛医学院阿兰·布朗（Alan Brown）实验室利用冷冻电镜单颗粒技术，首次解析了在利什曼原虫（L. tarentolae）中纯化的 native 状态的鞭毛内转运-A 复合物的近原子分辨率结构。
结构揭示了鞭毛内转运-A 由两个子复合体鞭毛内转运-A1 和鞭毛内转运-A2 组成，它们由位于躯干中间的旋转接头连接在一起。在 native 利什曼原虫中，鞭毛内转运-A 复合体采取相对“close”的构象。
（来源：Cell）他们发现鞭毛内转运-A1 和鞭毛内转运-A2 之间的相对旋转以及鞭毛内转运-A1 的灵活性，是成功聚合顺行 IFT train 的关键特征。
另外，该团队还发现鞭毛内转运-A 可以通过它的 TPR 结构域结合体外重组的脂质体膜，并且对磷脂酸和神经酰胺具有特异性。令人惊讶的是，在顺行 IFT train 中，鞭毛内转运-A 的 TPR 结构域界面也与鞭毛内转运-B 相互作用。
这一结果表明鞭毛内转运-A 结合膜，与在纤毛基部组装在顺行鞭毛内转运-B 上可能存在竞争关系。该团队还利用 AlphFold2 预测了人源鞭毛内转运-A 单个亚基的结构。根据这一鞭毛内转运-A 复合体结构，课题组构建了人源鞭毛内转运-A 的原子模型，分析了具有致病性的鞭毛内转运-A 突变在复合物上的位置、以及可能与识别运输蛋白相关的关键性位点，为以后鞭毛内转运-A 的功能性验证、以及鞭毛内转运-A 运输的货物蛋白的发现提供了新思路。
评审专家分别表示：
“这项研究将构成未来所有研究纤毛的生物学家的参考。在方法、实验质量或手稿准备方面几乎没有错。随着目前正在审查或预印本中的大量论文，我们将很快对顺行 IFT train 中的鞭毛内转运-A、鞭毛内转运-B 和马达蛋白有近乎原子的理解。这种令人兴奋的进步在几年前是不可想象的，而目前的手稿提供了这个巨大难题的核心部分。”
“这些结果的重要性在合理化人类鞭毛内转运-A 突变导致的疾病、在对鞭毛内转运-A 进行新突变的研究、以及对鞭毛内转运-A 如何在纤毛控制中发挥作用的研究中得到了强调。这项工作是该领域的里程碑，（预计）将被多次引用。”
值得注意的是，这种结构是通过直接从利什曼原虫纤毛中分离得到的，而不是使用已知的鞭毛内转运-A 蛋白进行重组。这提供了一个真正的近乎原生的复合体，克服了鞭毛内转运-A 复合体固有的灵活性带来的挑战。
该团队将两个子复合体（A1 和 A2）解析为高分辨率。尤其是，从“真实的”冷冻电镜数据中获得高质量的结构是非常宝贵的，它可以作为其他研究采用的 AlphaFold2 / XL-MS 方法的验证。
据介绍，2019 年他们就对纤毛内运输机制的分子机理非常感兴趣并且开始了尝试，研究中遇到了两个难点：首先就是如何获得完整的复合物蛋白样品。
对于样品的纯化，课题组优先希望能尽可能提取内源状态的鞭毛内转运复合物。同时如果万一拿不到内源状态的蛋白样品也要有计划 B，即利用体外重组表达蛋白。
为了获取内源状态的鞭毛内转运复合物，他们分别在衣藻（C. reinhardtii）和利什曼原虫（L. tarentolae）中进行了尝试，人为基因编辑复合物的一个亚基让它带上用于蛋白提纯的标签，然后通过亲和纯化以希望获得完成的复合物。
经过课题组的 Shimi Meleppattu 博士的努力，他们最后在利什曼原虫中通过纯化分别获得了鞭毛内转运-A 和鞭毛内转运-B 的复合物。
但是接下来遇到了另一个更大的难点：尽管提纯的复合物在分子筛以及负染电镜检测下表现很好，然而当他们尝试制备冷冻样品时，复合物在冷冻载网上就解聚了。
经过两年多的尝试，通过改变不同的制样条件、尝试不同的载网，论文一作周海霞终于成功获得了具有复合物颗粒的载网，并通过一些列数据处理最终解析了鞭毛内转运-A 复合物的近原子分辨率结构。
周海霞说：“当我拿到这个结构的时候，我们先是第一次解析了鞭毛内转运-A 复合物的不同亚基之间是如何相互作用的这一问题。随后我们希望知道鞭毛内转运-A 复合物如何在 IFT train 中组装以及如何和鞭毛内转运-B、潜在的运输货物蛋白相互作用。”
为此，课题组结合自己解析的高分辨率结构和已有的鞭毛内转运-A train 的 cryo-ET map 以及结合 AlphaFold 新技术，对这些问题提出了合理的假设。
周海霞表示：“记得当我第一次通过小量冷冻电镜数据成功看到有希望的颗粒和 2D 时，我跟导师 Dr.Brown 十分激动。即使当时是美国的节假日，我们决定立刻大量收数据。我在电镜室度过了全部的假期，心情十分激动并且特别庆幸因为节假日而临时有充足的机时。”
最终，相关论文以《鞭毛内转运-A 聚合成纤毛运输序列的机理》（Mechanism of 鞭毛内转运-A polymerization into trains for ciliary transport）为题发在 Cell 上，Shimi Meleppattu 和周海霞是共同一作，Alan Brown 担任通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Cell）
在该领域还有很多重要的待解决的问题，比如课题组还在努力解析鞭毛内转运-B 的复合物，尝试寻找与鞭毛内转运-A 结合的货物蛋白或鞭毛内转运-A 的货物接头蛋白以及他们的相互作用。
图 | 周海霞（来源：周海霞）另据悉，周海霞于 2019 年 9 月开始在哈佛医学院进行博士后研究，并获得了 2021-2022 年的 Merk Fellowship（默克公司支持的博士后基金）。更早之前，其本科毕业于西北农林科技大学，2014 年保送进清华大学读博。博士期间，曾参与首次解析感染人的冠状病毒的 spike 蛋白结构，并研究了 MERS 冠状病毒及其与新表位抗体的作用机理。目前，她正在关注并寻找国内职位，目标方向是想通过冷冻电镜以及生物化学等技术，研究纤毛相关疾病的科学问题。
参考资料：
1.Meleppattu, S., Zhou, H., Dai, J., Gui, M., & Brown, A.（2022）. Mechanism of 鞭毛内转运-A polymerization into trains for ciliary transport. Cell, 185(26）, 4986-4998.
