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NK细胞的定义和发现
正常人体每天都将产生上百个癌变细胞，但它们在形成癌症病灶前就已全部被免疫细胞军团消灭。在这些免疫细胞军团中，自然杀伤细胞（Natural killercell, NK细胞）是天然免疫系统中最重要的细胞，发挥着举足轻重的作用。
NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞来源于CD34+共淋巴祖细胞。据估计，NK细胞的半衰期大约为7~10天，占人类外周血淋巴细胞总数的10-15%，也存在于脾脏、肝脏、肺、骨髓和淋巴结中，它们通过与DC细胞的相互作用发挥关键的免疫调节功能。终末分化的 NK 细胞缺乏B淋巴细胞（CD19+）和 T 淋巴细胞（CD3+）的表型标记，CD56是NK细胞特征的标志。
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NK细胞治疗癌症
美国马里兰大学的马瑞沙博士在《自然》杂志上揭示了这一问题：NK细胞像“分子巡逻队”一样，在血流中到处巡视，一旦发现失去自我标识（称为MHC）的外来细胞或变异细胞，NK细胞的受体立即就发出信号，冲到目标的细胞膜上，向它释放有毒的颗粒，迅速将靶细胞溶化，在5分钟之内使癌细胞死亡。
NK细胞来源非常广泛，比如外周血、脐带血、 诱导多能干细胞（iPSC）和NK细胞系。NK细胞分泌IL-3和GM-CSF，不太可能引起细胞因子风暴。NK细胞分泌PD-1的水平较低，免疫抑制作用较小。此外，NK细胞可促进DC细胞迁移到肿瘤中，从而增强抗PD-1免疫治疗。
NK细胞对肿瘤细胞具有一定的杀伤效果，而且不受MHC识别的限制，是肿瘤免疫治疗的潜在治疗方式。异体NK细胞移植几乎不会诱发移植物抗宿主病 （GVHD），不会导致细胞因子风暴，可以作为完全“现货型”产品使用。
以上这些优点，使NK细胞成为抗实体瘤的理想候选细胞。
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CAR-BK肿瘤免疫细胞疗法
CAR-BK细胞，能通过CAR特异性识别肿瘤表达的抗原，还能通过NK细胞受体自身来消除肿瘤。嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）及一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。
NK细胞的活性取决于是刺激和抑制信号的平衡，而不是抗原特异性。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。NK细胞的另一种杀伤机制，涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。因此，CAR-NK细胞的靶向裂解基于CAR依赖和NK受体依赖机制，并且裂解也适用于抗原阴性膜的肿瘤。
构建CAR-NK是为通过基因编辑新建一条活化NK细胞的激活通路并增强其抗肿瘤效应，且兼具靶向性(如CD19, CD20)。基因的稳定转染是实现NK细胞稳定表达CAR的前提。NK细胞使用传统的电穿孔法和脂质体转染效率低下，因此多数使用逆转录病毒和慢病毒载体。
CAR-NK制备工艺复杂，过程中的无菌操作、细胞纯度、制备成品安全性等质量控制对后期的疗效有着重要影响，所以确保生产过程的标准化和自动化，做到药效和风险可控是首要任务。因此CliniMACS Prodigy GMP级细胞处理平台，将是目前CAR-NK细胞制备不可或缺的自动化系统。
CAR-NK制备流程
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CAR-NK细胞免疫治疗的研究现状
（1）血液瘤
CD19-CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有很高的应答率，并且易于制造，与目前的CAR-T细胞免疫疗法相比，这是一个巨大的进步。CD19-CAR修饰的NK细胞具有比CAR-T更明显的优势，有望显示出更好的抗肿瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK细胞临床研究也针对CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有几种针对血液恶性肿瘤的CAR-NK细胞临床试验正在进行中。
（2）实体瘤
CAR-T治疗的一个主要障碍是缺乏对实体瘤的疗效。这是由于肿瘤灌注不良、TAA异质性和实体瘤伴发的免疫抑制肿瘤微环境（TME）所致。CAR-NK疗法试图解决这些问题，一些临床试验已经应用于实体恶性肿瘤的治疗。在实体瘤中进展最为广泛的CAR-NK疗法包括检查点分子程序性细胞死亡蛋白-1配体（PD-L1）以及常见的肿瘤相关抗原HER2和MUC1为靶点。
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CAR-NK细胞面临的临床应用障碍
体外扩增NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的第一道障碍。单个供体的NK细胞数量不足以进行治疗，这使得NK细胞的扩张和激活变得非常重要。这一生产过程通常需要两到三周的时间来培养NK细胞和某些细胞因子（IL-2或与IL-15或抗CD3单克隆抗体联合使用）。此外，必须完全清除T细胞，以防止GVHD。
选择合适的方法转化CAR到NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。到目前为止，病毒载体和非病毒载体都被用来转化CAR。虽然逆转录病毒载体的转染效率很高，但它可能会引起插入突变、致癌和其他不良反应。而慢病毒载体尽管显示出较低的插入突变发生率，但其对外周血NK细胞的转染效率低至20%。
mRNA转染CAR-NK细胞也被认为是一种安全、实用的转染方法。研究表明，在异种移植肿瘤模型中，用mRNA方法电穿孔24小时后受体表达水平超过80%，转染mRNA的NK细胞表现出明显的细胞毒性。最近有研究表明，转染mRNA可以有效地避免CAR修饰免疫疗法临床应用的一个重要限制因素“靶向非肿瘤”毒性。然而，通过电穿孔方法转染mRNA的CAR-NK细胞的抗肿瘤作用将是暂时的，因为CARs的表达水平不会超过3天。
自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有自己独特的优点，但仍面临着一些挑战。这些挑战包括细胞增殖的改善，使细胞毒性的激活更有效，以及最终找到NK细胞的最佳重建方法。相信解决好这些问题，基于NK细胞优秀的抗肿瘤血统，极有可能在CAR修饰的武装下为肿瘤治疗带来新的突破。
