Nature Biotechnology | 让细胞自己筛出最优代谢通路：一种全新的哺乳动物代谢工程范式

哺乳动物依赖食物获取缬氨酸、异亮氨酸等必需氨基酸（essential amino acids, EAA），并不是因为这些分子无法合成，而是因为相关生物合成能力在漫长进化过程中已经丢失。问题是：如果把微生物中的代谢酶重新装进哺乳动物细胞，能否把这种能力重新建立起来？

近日，《Nature Biotechnology》的研究报道“Highly multiplexed mammalian metabolic engineering with a shotgun approach”，给出了一个颇有冲击力的答案。研究人员开发了一种“散弹式遗传工程”（shotgun genetic engineering, SGE），一次并行筛选数百万种合成代谢通路组合，不仅让中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells, CHO）高效自主合成缬氨酸，还建立了哺乳动物细胞的异亮氨酸生物合成能力。

这项工作值得关注的，也许并不只是“合成出了两种氨基酸”，而是它改变了一个更基础的问题：面对复杂细胞工程，我们是否还应该先设计出一条自认为最优的通路，再去验证它？

难点从来不只是“选哪几个基因”

传统代谢工程很容易给人一种错觉：找到缺失的酶，把相应基因导入细胞，问题似乎就解决了。

现实远比这复杂。

一条由多个酶组成的合成通路中，不仅要决定使用哪些基因，还要决定每个基因表达多强、各酶之间保持什么比例、蛋白被送到细胞质还是线粒体，以及一个细胞中需要多少拷贝。

换句话说，决定通路功能的不是简单的“基因列表”，而是一整套基因组成、表达强度、化学计量关系和亚细胞定位的组合。

当这些变量同时变化时，组合数量会迅速膨胀。

这也是哺乳动物细胞代谢工程特别困难的原因之一。细菌和酵母生长快，可以不断进行“设计—构建—测试”（design–build–test, DBT）循环；而哺乳动物细胞倍增时间通常超过20小时。与此同时，随着构建DNA越来越长，递送效率也会显著下降。

SGE的思路，就是不再逐条构建完整通路。

不再“造一条路”，而是让数百万个细胞同时试路

SGE使用的基本单位不是完整代谢通路，而是较小的转录单元（transcription unit, TU）。

每个TU可以包含不同的编码序列（coding sequence, CDS）、启动子以及细胞器定位信号，并且附带能够被测序识别的条形码（barcode）。

研究人员把大量不同TU混合在一起，再以较高感染复数（multiplicity of infection, MOI）递送到细胞中。

结果是：一个细胞可能获得这一组TU，另一个细胞则获得另一组。

如果随后施加选择压力，例如把培养基中的缬氨酸去掉，那么不能自己制造缬氨酸的细胞逐渐失去竞争力，而恰好获得有效合成通路的细胞会扩增。最后只需要读取这些存活细胞中的条形码，就可以反推出哪些组合发挥了作用。

这相当于把传统的：

“设计一个方案→构建→验证→失败→重新设计”

变成

“同时制造大量随机方案→让功能表型筛选答案→再解析成功组合”

这里的关键不是随机本身，而是随机之后可以被追踪、被选择、被解码。

40种元件，已经形成百万级组合空间

为了验证SGE，研究人员选择了支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAA）中的缬氨酸和异亮氨酸。

他们建立了一个包含10种编码序列的文库，每种编码序列又与两种启动子以及是否携带线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequence, MTS）相组合，最终形成40种TU。

研究人员感染了约242万个CHO细胞，实验估算MOI为8.8。蒙特卡洛模拟（Monte Carlo simulation）显示，当MOI约为8时，这批细胞中预计可以出现约156万种不同的通路组合。

这正是SGE与常规逐个构建策略的差异所在。

研究人员并不知道哪一个组合一定成功，但他们有机会让大量候选答案在同一个培养体系中竞争。

第一关：把缬氨酸合成从“能用”优化到接近正常生长

缬氨酸并不是研究团队第一次尝试。

此前，他们曾通过理性设计（rational design）把来自大肠杆菌的 ilvN、ilvB、ilvC和ilvD 导入CHO细胞，使细胞获得缬氨酸原养性（valine prototrophy），也就是在没有外源缬氨酸的情况下仍然能够增殖。

但效果并不理想：此前设计的细胞在无缬氨酸培养基中的倍增时间约为3.77天。

使用SGE后，研究人员从低缬氨酸条件下分离了16个克隆，16/16都达到设定的缬氨酸原养性标准。

其中两个表现突出的克隆，CHO-Val-D1和CHO-Val-D3，在完全缺乏缬氨酸的培养基中，倍增时间分别只有1.14天和1.05天，相当于各自在正常含缬氨酸培养基中生长速度的83%和80%。

更重要的是，研究团队使用稳定同位素进行了代谢追踪。

当培养基提供13C标记的碳源时，这两个克隆中检测到的13C标记缬氨酸比例分别达到96.5%和96.6%；此前理性设计细胞只有32.2%。

意外的答案：问题可能不在酶，而在酶被放在哪里

解析成功克隆之后，一个反复出现的信号非常醒目：线粒体定位（mitochondrial localization）。

在缬氨酸原养性较强的克隆中，ilvN、ilvB、ilvC和ilvD同时定位在线粒体中的情况，相对于随机组合的理论预期富集了大约48倍；研究人员甚至没有观察到四个基因全部位于细胞质中的成功组合。

这个结果很值得思考。

传统代谢工程经常把注意力集中在“使用哪个酶”和“表达多少”。这项研究提示，还有一个变量可能长期被低估：

为什么是线粒体？

该研究提出了几个可能解释。线粒体与细菌具有进化联系；同时，线粒体中的丙酮酸浓度、铁硫簇以及硫胺素焦磷酸等辅因子环境，也可能更有利于这些酶发挥作用。另外，把多个酶限制在较小空间中，也可能提高局部酶和底物浓度。

这些目前更多属于机制解释，而不是已经完全验证的因果结论。

但工程意义已经非常明确：亚细胞定位本身可以成为代谢通路设计的重要参数。

更难的一关：恢复异亮氨酸合成能力

异亮氨酸才是这项研究中难度更高的一部分。

此前那套能够制造缬氨酸的四基因组合，并不能让CHO细胞摆脱对外源异亮氨酸的依赖。

研究团队因此扩大搜索空间，引入不同的苏氨酸脱氨酶变体以及不同的乙酰羟酸合酶亚型，希望同时解决底物供应、反馈抑制和酶催化特性等问题。

低异亮氨酸选择后，他们一共分离了46个克隆，其中19个，也就是41%，表现出高于对照的异亮氨酸合成能力。

表现最好的CHO-Ile-10-H1细胞，在完全缺乏异亮氨酸的培养基中仍能连续增殖，倍增时间为1.69天，达到其正常条件生长速度的48%；另一个克隆CHO-Ile-10-H2的倍增时间为3.04天。

稳定同位素结果进一步显示，两个克隆中分别有78.5%和39.5%的异亮氨酸呈现13C标记，支持这些异亮氨酸来自细胞内部重新建立的合成过程。

研究最终锁定了一套包含 ilvB、ilvC、ilvD、ilvG、ilvM 和反馈抑制部分不敏感的 ilvAL481F 在内的六基因方案。

而线粒体再次出现。

在分析的46个克隆中，研究人员没有观察到六个相关编码序列全部定位于细胞质的情况。

从进化尺度来看，这个结果尤其引人注意：论文指出，这类必需氨基酸生物合成能力在哺乳动物谱系中已经消失超过5亿年。

现在，一套来自细菌的基因组合，在合适的表达和细胞器定位条件下，又让哺乳动物细胞获得了这种能力。

把方法搬到人T细胞，成功和失败同样重要

如果SGE只能在CHO细胞中工作，它的意义仍然有限。

研究人员进一步使用同一套文库处理人Jurkat T细胞。

约300万个Jurkat细胞被感染，实验MOI约为3.4。经过低缬氨酸选择后，研究人员分离了119个克隆，其中85个，也就是71%，达到缬氨酸原养性的判定标准。

两个代表性克隆在无缬氨酸条件下的倍增时间分别为2.02天和1.87天，达到各自正常生长速度的50%和52%。

但异亮氨酸的结果完全不同。

Jurkat细胞连续培养32天，研究人员仍然没有获得异亮氨酸原养性细胞。

乍看之下，这似乎是实验失败。

但此前模拟已经预测，在较低MOI下，只有约0.06% 的细胞可能获得六基因异亮氨酸方案，而所有关键成分同时处于理想亚细胞定位状态的概率几乎为零。

“搜索空间覆盖率”开始变成一个可以定量规划的实验参数。

当数百万次试错成为数据，机器学习才开始有意义

SGE还有第二层价值。

大量细胞的基因组合与功能表型形成了一套训练数据：哪些TU组合存在、每种组合的丰度如何、细胞最后能不能合成缬氨酸。

研究人员利用这些信息训练随机森林（random forest）分类模型。

在四折交叉验证（fourfold cross-validation）中，模型区分缬氨酸原养性与营养缺陷型细胞的平均准确率达到0.942±0.005，ROC曲线下面积（AUROC）为0.993±0.006，精确率—召回率曲线下面积（AUPRC）达到0.997±0.002。

119个克隆中，模型正确分类了112个。

更有意思的是，模型认为最重要的四个特征，正是 PGK启动子驱动、并定位于线粒体的ilvN、ilvC、ilvD和ilvB——与研究人员从生物学分析中得到的通路结构高度一致。

不过，这组漂亮的数据必须谨慎解读。

部分Jurkat克隆来自同一祖先细胞扩增，具有“兄弟克隆”（sibling clones）关系。去除这些重复来源之后，模型在59个克隆中正确预测了53个。

这是两个完全不同的结论。

这项工作的价值，不只是“给细胞增加一种能力”

SGE展示了一种很有启发性的工程范式。

过去，我们往往希望先充分理解系统，然后据此设计最优方案。

但面对数十个甚至数百个相互作用变量，这条路线会越来越困难。

SGE提供了另一种选择：

值得注意的是，最终找到的有效克隆包含大约23–52 kb的合成DNA。这样的规模已经超出了常规大规模组合筛选较容易处理的范围。

而且SGE并不要求最终产品永远保持随机、多拷贝整合状态。研究团队根据筛选结果重新构建了紧凑的缬氨酸通路，并进行定点整合；重新构建后的CHO细胞在无缬氨酸条件下仍能以1.25天一次倍增的速度生长，达到正常条件的74%，明显优于此前的理性设计方案。

因此，SGE更适合作为一个发现平台：

先用大规模随机组合寻找规律，再把有效规律重新工程化。

但距离“任意改造哺乳动物代谢”还很远

这项研究也有几个不能忽视的局限。

首先，目前SGE高度依赖可选择表型（selectable phenotype）。这项实验之所以高效，是因为“没有目标氨基酸还能不能活”本身就是非常强的筛选机制。如果研究的是一个不会直接影响生存或增殖的代谢产物，就需要额外建立生物传感器（biosensor）、表面标志物或者人工遗传回路。

其次，研究使用慢病毒进行随机整合，文库在病毒包装过程中出现了明显偏倚，例如EF1α启动子驱动的TU明显不足；慢病毒还可能发生模板转换和条形码错配。

再次，检测到一个条形码，并不等于对应基因一定按照预期表达。基因沉默、整合结构和克隆异质性都会影响解释。

最后，SGE筛选出来的复杂多TU结构如果重新压缩成单个载体，基因之间的调控关系可能改变，因此仍然需要重新验证。

这是从实验结果走向医学应用时必须保留的距离。

当我们不再试图猜中答案，复杂细胞工程可能会出现另一条路线

这项研究值得关注的，也许不是96.6%的13C标记缬氨酸，不是217倍的线粒体富集，也不是0.993的AUROC。

因为它提醒我们，复杂生命系统可能不存在一条仅靠直觉就能找到的“标准答案”。

未来的细胞工程，或许会越来越像这样：研究人员负责定义合理的搜索空间，细胞负责完成大规模并行试验，筛选负责保留有效方案，测序负责解码，而机器学习再从这些实验结果中寻找下一轮设计规律。

这形成了一个新的循环：

对于合成生物学（synthetic biology）、细胞治疗（cell therapy）和生物制造（biomanufacturing）而言，这可能比重新获得某一种氨基酸的合成能力更重要。

参考文献

Trolle J, Sessa S, Wudzinska A, Grivainis M, Rincones K, Rodrick T, Jones DR, Fenyö D, Pinglay S, Boeke JD. Highly multiplexed mammalian metabolic engineering with a shotgun approach. Nat Biotechnol. 2026 Oct 6. doi: 10.1038/s41587-026-03318-7. Epub ahead of print. PMID: 42839049.

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