肉苁蓉具有多种保健功能，具有明显的药用价值和经济价值。研究表明肉苁蓉总苷（TG）具有保肝护肝、神经保护、抗氧化和改善记忆的作用。人体的生物屏障、免疫系统与庞大的肠道菌群之间形成一种微妙的和谐共生关系，始终处于动态、复杂的人体生态系统中。肠道微生物群组成及其代谢物与肝癌的发生密切相关，之间存在复杂的相互作用。专家学者们发现肠道菌群及其代谢物是肝癌发展中的重要参与者，因此从新视角深入了解肠道微生物在肝癌中的作用机制尤为重要。而目前，肉苁蓉TG对肝癌小鼠的研究少有报道。
北京联合大学生物化学工程学院的冯朵、王靖、闫文杰*等将HepG2肝癌细胞皮下注射到小鼠右后腿处，待细胞不断增殖成瘤，期间给小鼠灌胃不同剂量TG，观察药物对裸鼠体内肿瘤的抑制作用，从氧化应激、调节免疫、改善代谢和平衡肠道微生物层面深入探讨TG在裸鼠体内的抗肿瘤效果，以期为TG深度开发为抗肿瘤药物提供理论依据。
1 TG对HepG2肝癌小鼠体质量的影响
为了确定药物干预过程是否会影响裸鼠的正常生长，在饲喂期间对裸鼠的生长、饮食、活动能力进行跟踪观察，发现裸鼠在整个饲喂过程中，体质量正常生长、饮食正常，无毒副作用，这与Gao Yuqiu等的研究结果一致。说明TG在抑制裸鼠实体瘤的同时，不会影响裸鼠的正常生长。
随着肿瘤的不断长大，在干预后期，模型组小鼠精神状态欠佳、行动缓慢、食欲下降、体型变瘦、活力下降、皮肤泛白，逐渐表现出恶病质症现象；其他处理组的裸鼠精神状态良好、皮肤红润、活动能力正常；在干预前期，TG各剂量组体质量生长速率较其他组更高（图1），由此推断TG可以给裸鼠提供一定的营养补充，但TG各组之间体质量没有差异。
整体来看，裸鼠干预前期体质量增长快速，可能是由于肿瘤的快速增长促进了小鼠的摄食，导致体质量快速增长；中间增长趋势缓慢，可能是肿瘤的增长进入了平台期；而后期体质量的增长可能是由于肿瘤增长占据了主导地位。
2 TG对HepG2肝癌小鼠肿瘤体积的影响mm
为了观察药物是否可以抑制肿瘤的增长，每5 d测量一次裸鼠皮下实体瘤体积，通过表1发现，在干预前期，与模型组对比，处理组的增长趋势较为缓慢，当癌细胞快速繁殖，瘤体积不断扩大时，TG具有一定的抑制体内肿瘤体积的作用，且高质量浓度抑制效果更好（（716.59±514.46））。 3
3 TG对HepG2肝癌小鼠脏器指数、抑瘤率的影响
如表2所示，与模型组对比，经TG处理后的小鼠肝脏指数、脾脏指数均相应地降低，且具剂量-效应关系，但各组别之间均不存在显著差异（P＞0.05）。各处理组的肿瘤质量均小于模型组，说明TG对HepG2荷瘤小鼠体内肿瘤均有一定程度的抑制作用，抑瘤率分别为6.133 2%、18.270 6%、26.855 7%，具有剂量依赖性。由于小鼠存在个体差异，处理组抑瘤率虽有所增长，但是各组之间并不存在显著差异（P＞0.05）。
4 TG对HepG2肝癌小鼠组织的影响
如图2a所示，模型组显示不规则的结构和颗粒细胞质，大多数肝细胞体积肿胀，细胞质疏松，细胞间隙扩大，部分肝细胞显示周围微小性症细胞浸润现象。各处理组小鼠肝脏肝细胞结构较规则，坏死情况减少，炎性细胞浸润现象减轻，肝细胞多角或类圆形，呈清淡的嗜酸性着色，细胞核呈圆形或多角形，位于中央，染色质较稀疏，核膜清楚。
肿瘤组织HE染色结果显示，模型组小鼠肿瘤细胞正常，生长旺盛，细胞核大，肿瘤细胞排列不规则，分布紧密，细胞结构完整（图2b）。各处理组肿瘤细胞分布变得越来越稀疏，细胞核出现固缩，空泡变样程度增加，细胞破裂乃至溶解坏死现象，结构不清，其中，高剂量TG组肿瘤细胞坏死效果最明显。
5 TG对HepG2肝癌小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响
从图3可知，与模型组对比发现随着TG质量浓度的提高，脾脏淋巴细胞增殖能力逐渐上升，分别增长了5.96%、29.57%、54.88%，呈剂量依赖性，但组间不具有显著差异（P＞0.05）。该结果表明，TG可以通过改善小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力从而达到抑制肝癌小鼠体内肿瘤增长的效果。
6 TG对HepG2肝癌小鼠肝脏组织抗氧化指标的影响
在癌变和免疫系统受损发生时，机体的抗氧化能力也会下降。由图4可知，与模型组比较，各处理组的肝脏组织CAT活力都有所上升，低、中、高剂量TG组分别提高了7.62%、18.51%、39.31%，提高幅度较大，各组与模型组之间均存在极显著差异（P＜0.01）。与模型组对比，TG各剂量组（低、中、高）AKP活力分别下降了0.52%、3.76%、25.46%，其中，TG高剂量组与模型组存在极显著差异（P＜0.01）。与模型组对比发现，随着TG质量浓度的提高，各TG剂量组GPT活力分别提高了35.70%、53.59%、62.46%。低、中、高TG剂量组小鼠肝组织GOT活力较模型组分别下降了2.21%、11.00%、11.58%。综上，推测模型组的肝脏发生了非常严重的病变，处理组较模型组病变程度低，并且随着TG浓度的升高，其病变程度随之降低。结果表明TG可以提高小鼠抗氧化能力、缓解小鼠肝脏氧化损伤程度、改善肝脏抗氧化功能，从而起到抑制小鼠体内肿瘤生长的作用，提示后续可采用肉苁蓉辅助治疗肝癌患者以保护肝脏器官免受损伤。
7 肠道菌群代谢组学分析
由图5a可知，本实验正负离子模式合并后共鉴定得到1 889 种代谢物，其中正离子鉴定到1 163 种，负离子鉴定到726 种。对鉴定到的所有代谢物进行分类统计，按照化学分类归属信息主要包括有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、有机杂环化合物、苯环型化合物、有机氧化合物、苯丙烷类和聚酮类、有机氮化合物、核苷酸及其类似物等。
OPLS-DA是一种对偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行修正的分析方法，可以滤除与分类信息无关的噪音，提高模型的解析能力和有效性；在OPLS-DA得分图中，有预测主成分和正交主成分，OPLS-DA将组间差异最大化的反映在t上，可直接区分组间变异，而在正交主成分to上则反映了组内的变异，椭圆代表95%置信区间，点的分布状态反映组间、组内的差异度。由图5b可知，OPLS-DA模型可以区分A组和D组。
显著差异代谢物（VIP＞1，P＜0.05）的层次聚类分析结果如图5c所示，聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式，可能具有相似的功能或者共同参与同一代谢过程或细胞通路。图5c中每行代表一个差异代谢物，每列代表一组样品，红色代表显著上调，蓝色代表显著下调，颜色深浅表示上下调的程度，表达模式接近的代谢物聚在左侧同一聚类下。结果表明A组和D组代谢物明显不同，D组中茴香霉素、伊马替尼、拉贝洛尔、巨大戟醇、DL-正缬氨酸和原海葱苷A的含量较高，水杨酸含量较低，表明TG可显著调节肝癌小鼠肠道代谢物水平。
8 肠道菌群转录组学分析
群落结构组分图（图6a）可以展示每个样本或分组在不同分类水平上的群落结构，根据物种注释结果，选取A组和D组在属水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看在属水平上相对丰度较高的物种及其比例。由图6a可知，D组中拟杆菌属（Bacteroides）较A组升高，罗氏菌属（Roseburia）、丹毒丝梭菌属（Erysipelatoclostridium）较A组降低。
微生物覆盖率为测序深度指数，均在0.99以上，品种间文库覆盖率指数通过Tukey和Wilcox秩和检验，如图6b所示，A组和D组存在显著差异（P＝0.045＜0.05），D组菌群多样性高于A组，表明测序深度已基本覆盖样品所有的物种，可进行下一步数据分析。
β多样性指数组间差异分析中，箱形图可以直观地反映组内物种多样性的中位数、离散程度、最大值、最小值、异常值。通过Wilcox秩和检验发现A和D组间物种多样性差异极显著（P＝0.000 659 4＜0.01），组间差异大于组内差异（图6c），表明分组具有意义。
图6d、e分别是不同处理组小鼠样本LDA值分布柱状图及具有统计学差异的Biomarker柱状图，代表在A组和D组起重要作用的微生物类群。重点关注两组中差异菌属的相对丰度，A组中卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、鲁杰氏菌属（Ruegeria）和Tyzzerella_3菌属的丰度较高；D组中丁酸球菌属（Butyricicoccus）丰度较高。
9 显著差异菌群和显著差异代谢物联合分析
关联分析是数据深入挖掘的一种方式，主要用来发现隐藏在数据集中的关联性或相关性。16S rDNA与代谢的关联分析主要是基于统计学的算法发现显著差异菌群与显著差异代谢物之间的关联。为直观地反映显著差异菌群和显著差异代谢物表达模式的异同，对差异显著的菌群和代谢物进行Spearman相关性层次聚类分析。
层次聚类热图中每一行表示一个差异显著的菌属，每一列表示一种差异显著的代谢物。左侧树杈表示对差异菌属进行聚类的结果，上侧树杈表示对差异代谢物进行聚类分析的结果。聚类出现在同一个聚类的显著差异代谢物或者差异的菌属具有相似的相关性模式。层次聚类热图中每一个格子包含两种信息（相关系数r和P值）。r以颜色表示，r＞0表示正相关（红色）；r＜0表示负相关（蓝色），颜色越深表示相关性越强。图7展示了185 对显著性相关的差异菌属和代谢物，其中58 对的P＜0.01，相关性极显著。
A组和D组样本在代谢组学层面上以及菌群多样性上具有明显的区分，共筛选到12 个显著差异菌群与60 个显著差异代谢物。通过Spearman统计学分析方法，对两者之间的相关性进行计算，共找到72 对具有显著性正相关的菌群-代谢物，113 对具有显著性负相关的菌群-代谢物。
讨论与结论
前期研究TG在体外水平上，可以显著抑制HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡、坏死。因此需利用动物模型进行体内检测，从而对抗肿瘤药物进行全面分析解释，为肉苁蓉临床应用提供更准确的理论依据。选用HepG2细胞接种在裸鼠右后腿处，建立裸鼠皮下实体瘤模型，造模成功后，灌胃不同质量浓度TG，在整个饲喂过程中，测量小鼠体质量变化并分析小鼠的肿瘤体积增长趋势，监督观察其精神状态、饮食和活动能力，结果发现模型组小鼠精神状态较差，而处理组精神状态良好，且皮肤红润，此外，TG不会影响小鼠的正常生长，可以抑制小鼠皮下肿瘤体积的增长。
在HE染色中，苏木精染液呈碱性，可使细胞核着蓝紫色；伊红染液呈酸性，可使细胞质和细胞外基质着红色。该实验采用HE染色小鼠肝脏和肿瘤组织，发现TG可以减轻肝脏病理变化，缓解炎性细胞浸润现象。此外，TG在保护肝脏的同时，破坏肿瘤组织中肿瘤细胞结构，导致细胞坏死。HE染色结果直观地反映了肉苁蓉在肝癌小鼠中的肝保护和抗癌作用。
CAT是过氧化物酶体的标志酶，促使过氧化氢分解为水和氧分子，使细胞和组织器官免受H2O2的毒害。GPT是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶，是肝细胞损伤最敏感和特异的指标。GOT是反映肝细胞坏死程度的标准，主要存在于肝细胞线粒体中，可以通过检测肝脏组织中GOT的含量确定肝脏组织病变程度。AKP是一种膜结合酶，广泛存在于人体各脏器中，其中以肝脏含量最高。临床研究表明，当肝系统受到恶性肿瘤细胞刺激时，AKP水平增加。通过检测肝组织抗氧化指标，发现TG可以缓解小鼠肝脏氧化损伤程度，改善肝脏抗氧化功能，减轻肝癌小鼠肝脏病变程度，从而起到抑制小鼠体内肿瘤生长的作用。阻止肿瘤细胞侵害肝脏，为肉苁蓉作为辅助治疗或中医治疗药物在肝癌临床应用上提供一定的实验依据。
有大量临床数据和实验研究表明，许多癌症患者均有免疫功能低下的症状，首先是细胞免疫功能较低，在肿瘤生长过程中，体液免疫也在慢慢降低。有研究报道，肉苁蓉及其活性成分可以缓解化疗药物对免疫细胞造成的损伤，改善机体免疫功能。此外，肉苁蓉多糖能够促进小鼠淋巴细胞的增殖并释放Ca 2＋Ca 2＋
研究报道肝细胞癌患者在门静脉和粪便样本中的亚油酸和苯酚水平低于健康对照组，亚油酸和苯酚可显著抑制肝癌细胞增殖，表明代谢物在肝细胞癌的发病机制中起重要作用。研究发现茴香霉素激活p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通过介导H3S10磷酸化促进HCC细胞的铁死亡。伊马替尼可能通过miR-124和STAT3/HLF/IL-6通路发挥其抗肝纤维化活性。巨大戟醇可减轻肝和胃肠道损伤，减少腹水体积，加剧H22细胞凋亡程度，改善异常的促炎细胞因子。Nair等发现拉贝洛尔与细胞分裂周期因子20表现出显著的相互作用，可作为一种潜在的抗肝癌靶向药物。原海葱苷A对多种HCC细胞系具有很强的抗癌作用，可显著抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，与细胞凋亡、线粒体损伤、自噬密切相关，且对MHCC97H异种移植裸鼠中HCC细胞也有明显的抑制作用。本研究结果显示，肉苁蓉可通过调节代谢物水平抑制肝癌的发展。此外，负离子模式下，D组中正缬氨酸较A组升高，水杨酸较A组降低，这与肉苁蓉多糖缓解肠道微生物失调相关患者的学习和记忆障碍结果一致。
研究发现，卟啉单胞菌属会产生纤维化介质（例如转化生长因子-β1），加剧非酒精性脂肪型肝炎的纤维化。D组中较A组卟啉单胞菌属相对丰度低，表明TG可以缓解肝纤维化，从而抑制肝癌的发生。此外，一项研究中提到Tyzzerella_3可作为预测胃癌的潜在标志物，由此推测模型组可能已经发生了肿瘤转移情况，后续需要进一步研究探讨。TG可以改善丁酸球菌属相对丰度，这与Mu Hongna等研究柚皮苷减轻高脂肪饮食诱导的非酒精性脂肪肝病结果一致。表明TG可通过改善肠道微生物组成，减轻肝细胞持续损伤，抑制肝炎的发生，并在肝损伤后及时进行肝修复，在肝癌未发生时起到预防干预作用。
综上，肉苁蓉作为食药同源物质，富含营养价值和功能成分，可改善机体免疫能力，抑制肿瘤生长代谢，阻止肿瘤侵袭转移，调节机体代谢水平，改善机体肠道微生物组成等，表现出一定的抗肝癌作用。本实验关于TG抗HepG2肝癌效应的相关研究可以为肉苁蓉的后期开发利用和推广提供一定的理论依据和技术支撑。
本文《肉苁蓉总苷对HepG2肝癌荷瘤小鼠的影响》来源于《食品科学》2024年45卷第06期120-129，作者：冯 朵，王 靖，蒋勇军，周士琦，段 昊，李静圆，闫文杰*。10.7506/spkx1002-6630-20230509-072。
修改/编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。
