Akkermansia muciniphila对鼠伤寒沙门氏菌生长和毒力的抑制作用

Introduction

鼠伤寒沙门氏菌是最常见的食源性病原体之一，对全世界的公众健康构成威胁。由鼠伤寒沙门氏菌诱发的感染通常是在摄入受污染的食物或水后获得的。鼠伤寒沙门氏菌可引起从自限性胃肠炎到严重的、危及生命的侵入性感染（如败血症）的各种疾病。鼠伤寒沙门氏菌的致病性与各种毒力因素密切相关，如运动能力、生物膜的形成、黏附性和侵袭。生物膜是由分泌的多糖、蛋白质和细胞外DNA组成的混合物，有利于鼠伤寒沙门氏菌在食品加工厂这样的恶劣环境中生存。

肠道微生物群是一个庞大而多样的微生物群落，含有约100万亿（10

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）个细菌，在宿主的肠道健康中发挥着巨大的作用，包括促进不可消化的膳食纤维的利用，调节肠道的免疫反应，以及保护宿主肠道形成病原体。微生物群通过间接或直接的机制对病原菌产生抵抗力，如营养或生态位竞争和抗菌化合物的产生。更重要的是，各种研究探讨了肠道微生物群产生的分子或来自特定微生物群成员的代谢物可以减轻病原体的毒力，保护小鼠免受肠道病原体诱发的感染。

Akkermansia muciniphila是肠道黏液层中主要的黏液蛋白降解菌之一，在哺乳动物中的丰度约为2%-至5%。A. muciniphila可以增加产生黏液的杯状细胞的数量，加速黏液的周转率，对肠道屏障的完整性是有益。A. muciniphila已被证明可以减轻代谢紊乱，如肥胖症、高血压、自闭症和癌症。一些证据报道，A. muciniphila的某些有益作用源于其分泌分子和/或化合物，包括来自外膜的Amuc_1100和Amuc_2172，或分泌到A. muciniphila上清液中的磷脂酰乙醇胺（PE）。最近，从A. muciniphila的上清液中发现的一种特定的胰高血糖素样肽-1诱导蛋白P9表现出对代谢的益处。同时，最新的研究显示，A. muciniphila产生的β-咔啉生物碱可以保护小鼠免受蜱虫传播的病毒病原体的侵害。此外，也有报道说，A. muciniphila的减少与Citrobacter rodentium诱导的体内细菌感染有密切联系。

乳酸菌（LAB）是肠道的常驻成员之一，大量研究报告表明，抗菌物质，如细菌素、乳酸和过氧化氢对病原体有抗生长和抗病毒作用。然而，A. muciniphila中的代谢物是否以及如何影响食源性病原体还没有被充分探索。

大连工业大学刘佳秀博士、夏效东教授等探究了A. muciniphila上清液（CFS）对于鼠伤寒沙门氏菌生长及毒力因子的抑制作用，探讨了肠道益生菌与病原菌之间的相互作用。

Results and Discussion

图1显示了CFS对鼠伤寒沙门氏菌SL1344和鼠伤寒沙门氏菌14028的抗菌效果。当鼠伤寒沙门氏菌SL1344和鼠伤寒沙门氏菌14028与CFS共同培养时，其生长明显延迟，而且抑制作用是剂量依赖性的。36 h后，在没有CFS的情况下，鼠伤寒沙门氏菌SL1344和鼠伤寒沙门氏菌14028的OD值分别达到0.91±0.02和1.48±0.01，而在100% CFS的情况下，两株菌的OD值分别为0.59±0.01和0.982±0.01。

图1

A. muciniphila的CFS对两株鼠伤寒沙门氏菌运动性的影响见图2。如图2所示，经过CFS处理的鼠伤寒沙门氏菌SL1344和鼠伤寒沙门氏菌14028的运动性出现了明显的下降（P＜0.05），同样呈浓度依赖性。以上结果表明，CFS对于两株鼠伤寒沙门氏菌的运动性存在抑制作用，并且都呈浓度依赖性。

图2

细菌的表面疏水性和自聚集性对于细菌的生物膜形成非常重要，细菌表面疏水性和自聚集有助于细菌在各种多变的环境中生存和生物膜的形成。由此分析了A. muciniphila的CFS是否对鼠伤寒沙门氏菌的表面疏水性和自聚集性有影响。

从图3A和B可以看出，CFS对两株鼠伤寒沙门氏菌的细胞表面疏水性均有显著的抑制作用，抑制作用随着CFS浓度增加而提高，呈剂量依赖性。此外，从图3C和D可以看出，经过CFS处理的两株鼠伤寒沙门氏菌的自聚集也出现明显的下降，抑制作用随着CFS浓度增加而提高，也呈剂量依赖性。

图3

如图4A和B所示，CFS在24 h后对生物膜的形成活动有很强的抑制作用，呈现出剂量依赖的方式。扫描电子显微镜显示，未经处理的鼠伤寒沙门氏菌显示出更密集、更坚固的生物膜，而经处理的细菌形成的生物膜则不那么密集（图4C）。此外，通过SYTO9染色可以看出活菌较少（图4D）。这些发现表明，A. muciniphila的CFS在体外对鼠伤寒沙门氏菌有抑制生物膜形成的作用。

图4

CFS对鼠伤寒沙门氏菌黏附和侵袭能力的影响如图5A所示。经CFS处理的鼠伤寒沙门氏菌1344的黏附能力和侵袭能力显著降低。与此同时，还发现鼠伤寒沙门氏菌的入侵能力也有所下降（图5B）。考虑到CFS的酸化是否是抑制的影响因素，将CFS的pH值调整为7.5（C7.5），与肉汤（M7.5）相同。从图5C中可以看出，调整后的CFS（C7.5）对鼠伤寒沙门氏菌1344的黏附也有明显的抑制作用，但略高于原CFS（C6.0），但差异无统计学意义。同样，调整后的CFS也显著降低了鼠伤寒沙门氏菌1344的入侵能力。还发现未处理的肉汤（M7.5）和处理过的肉汤（M6.0）之间没有差异，这表明pH的降低与鼠伤寒沙门氏菌的黏附和侵袭抑制作用无关。

图5

为了确定CFS中哪些成分对其抗菌活性有贡献，对CFS进行了不同的处理，包括温度、pH中和、强酸和强碱以及各种蛋白酶。两株菌株经过不同温度处理后，CFS均未见明显的抑菌效果（图6A、B）。与原始CFS相比，经pH中和的CFS对鼠伤寒沙门氏菌的生长有所增加，说明CFS的抑菌作用可能与某些酸存在有关（图6C、D）。然后，经过强酸（pH 2.0）和强碱（pH 10.0）处理后，CFS仍能抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长（图6E、F）。经蛋白酶处理的CFS在12 h时对两种菌株保持抑菌性能，而部分处理的CFS在24 h时抑菌效果下降（图6G和H）。

图6  不同处理对CFS抗菌活性的影响

图7A，通过GC-MS测量CFS中SCFAs的水平。与对照相比，乙酸盐和丙酸盐在CFS中含量更高，分别达到（104.72±9.02）μg/mL和（218.56±4.46）μg/mL。而在异丁酸盐和丁酸盐方面没有观察到差异。为了确定CFS中的SCFAs是否限制了鼠伤寒沙门氏菌的生长，在培养基中加入了该浓度的乙酸盐和丙酸盐来研究SCFAs对于鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用。添加乙酸盐和丙酸盐（SCFAs）抑制了鼠伤寒沙门氏菌的生长，而经过pH调整的SCFAs（SCFAs-A）对鼠伤寒沙门氏菌的生长抑制作用更强（图7B、C）。这些结果表明，A. muciniphila的CFS中的SCFAs能够在体外废除鼠伤寒沙门氏菌的生长。

图7

通过UHPLC-MS/MS进行代谢组学分析，探索CFS的其他代谢物。总共确定了484个阳性模式的代谢物和435个阴性模式的代谢物。PLS-DA显示，相同时间点的样品聚集在一起，不同时间点的样品在两种离子模式下相互分离（图8A，B）。这表明所有的样品都显示出理想的重现性，而且A. muciniphila在不同时间点产生的代谢物与培养基有明显的差异。然后检查了三组中每组的前50个代谢物（图8C）。使用热图层次聚类分析揭示了三组之间不同的代谢物。根据人类代谢组数据库（HMDB）的分类，三个主要的代谢物是有机酸、脂类和有机杂环化学品（图8D）。图8E和8F显示了前20条代谢途径。有几条代谢途径在CFS和原始生长培养基之间有明显差异，如C5-支链二元酸代谢、乙醛酸、二羧酸代谢和柠檬酸循环（TCA循环）。

图8  UHPLC-MS/MS分析

Conclusion

综上所述，A. muciniphila的CFS可抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长、细菌生物膜的形成以及细菌对肠上皮细胞的黏附和侵袭。多种有机酸可能与CFS的抗生物膜和抗毒作用有关。这些发现表明，A. muciniphila的CFS具有开发为食品应用中的抗菌剂或添加剂的潜力，以控制鼠伤寒沙门氏菌污染或预防鼠伤寒沙门氏菌相关感染。

通信作者

夏效东，大连工业大学食品学院教授，博士生导师。海洋食品加工与安全控制全国重点实验室、国家海洋食品工程技术研究中心食品微生物与健康团队负责人。主要从事食品-肠道菌群-宿主的互作及对健康的影响及其机制、食源性致病菌的环境耐受及其控制技术等相关研究。在Journal of Advanced Research、Cancer Research、Trends in Food Science and Technology等相关期刊发表SCI论文150余篇。任Frontiers in Microbiology、Foods等期刊副主编及编委、Current Research in Food Science、Pathogens等期刊客座编辑。教学方面主要承担食品微生物、食源性致病菌、文献检索与科技论文写作等课程教学。任辽宁省食品科学技术学会理事、陕西省微生物学会理事。获批教育部新世纪优秀人才，辽宁省兴辽计划青年拔尖人才等。主持国家自然科学基金、十四五及十二五国家科技支撑计划课题、子课题以及省部级课题等项目20余项。研究成果为畜禽、乳品及水产中微生物污染的控制以及肠道健康食品的开发提供理论依据和技术支撑。

Anti-biofilm and anti-virulence potential of cell free supernatant ofAkkermansia muciniphilaagainstSalmonella

Jiaxiu Liu, Wenxiu Zhu, Huanhuan Liu, Xiaomeng Ren, Ningbo Qin, Xiaodong Xia

*

National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

*Corresponding author.

Abstract

Akkermansia muciniphilais one of the commensals residing within the mammalian gut and co-evolving with the host. Numerous studies have demonstrated the benefits ofA.muciniphilain ameliorating metabolic disorders, while little is known about the antimicrobial potential ofA.muciniphilaagainst pathogens. Here, we examined the antimicrobial and anti-virulence properties of cell free supernatant (CFS) ofA.muciniphilaagainstSalmonellaTyphimurium. CFS retarded bacterial growth and inhibited the motility ofS.Typhimurium SL1344 andS. Typhimurium 14028. CFS dose-dependently reduced cell hydrophobicity and auto-aggregation of both strains. Also, CFS fromA.muciniphilasignificantly attenuated biofilm formation. Compared with untreated bacteria, CFS-treated bacteria significantly decreased adhesion and invasion to Caco-2 cells, and reduced intracellular survival in macrophages. CFS maintained antimicrobial properties after treatment with high temperatures and various proteases, while it lost its antimicrobial activity after pH neutralization. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) confirmed thatA.muciniphilaproduced a certain amount of acetate and propionate, and ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS) identified other organic acids and metabolites in CFS. In summary, CFS fromA.muciniphilaexhibited anti-biofilm and anti-virulence properties againstSalmonellaand could be potentially utilized in the food industry for controllingSalmonellacontamination and reducing infection.

Reference:

LIU J X, ZHU W X, LIU H H, et al. Anti-biofilm and anti-virulence potential of cell free supernatant ofAkkermansia muciniphilaagainstSalmonella[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2677-2689. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250215.