华南农业大学吕慕雯副教授等：基于脂质组学研究胡椒碱对肥胖大鼠

生物钟系统在哺乳动物中起着关键作用，控制着昼夜节律的振荡，涉及细胞、器官和组织层面。昼夜节律紊乱可能导致脂质代谢异常和肥胖。胡椒碱（PIP）具有多种生物功效，包括调节代谢，且本研究发现其通过Bmal1/Clock依赖的方式影响肝细胞脂质代谢。

华南农业大学食品学院的张玮芸、吕慕雯*及罗格斯大学食品科学系的HO Chi-Tang通过建立HFD诱导的肥胖大鼠模型，在明确PIP减脂效果的基础上，采用余弦函数拟合分析PIP对肥胖大鼠肝脏中生物钟基因和脂代谢相关基因的昼夜节律恢复作用，并结合脂质组学探究PIP干预后肥胖大鼠的肝脏脂质代谢物变化，基于生物钟基因的节律性表达探究PIP对大鼠减肥降脂作用的可能机制。

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PIP对大鼠饮食、体质量和肝脏指数的影响

如表2所示，在9 周的喂养结束后，HFD组大鼠体质量增长率高度显著高于ND组（P＜0.001），其肝质量比显著高于ND组（P＜0.05）；而PIP组的大鼠体质量增长率高度显著低于HFD组（P＜0.001），其肝质量比显著低于HFD组（P＜0.05）。这表明PIP可以抑制HFD喂养大鼠体质量增长和肝脏增大。同时，3 组间的摄食量无显著差异，表明PIP并不是通过减少能量摄入发挥降脂效果。

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PIP对肥胖大鼠血脂水平的影响

AST和ALT是反映肝脏细胞损伤和细胞膜完整性的重要指标，当肝脏受损时，细胞中转氨酶被释放到血液中，血清中的AST和ALT水平显著升高。因此，本实验通过检测血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平，评估PIP对HFD诱导脂肪肝和高脂血症的预防作用。如图1A、B所示，与ND组相比，HFD组的血清ALT水平（P＜0.01）和AST水平明显升高（P＜0.05），表明长期摄入高脂食物造成了肝脏损伤；与HFD组相比，PIP组大鼠的ALT和AST水平显著下降（P＜0.05），表明PIP对HFD诱导肥胖大鼠的肝脏损伤具有防护作用。如图1C～F所示，与ND组相比，HFD组的血清TC和TG水平高度显著升高（P＜0.001）、LDL-C水平极显著升高（P＜0.01）、HDL-C的水平显著降低（P＜0.05）；与HFD组相比，PIP组的血清TC、TG、LDL-C水平显著降低（P＜0.05），这些结果表明PIP缓解了HFD引起的大鼠血脂水平紊乱。综上，PIP改善了长期摄入HFD引起的大鼠肝脏损伤和血脂水平紊乱。

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PIP对大鼠肝脏生物钟基因昼夜节律紊乱的影响

最近的研究表明，HFD可以影响哺乳动物体内的生物钟系统，干扰神经、体液和激素等信号的传递过程，导致机体代谢紊乱。肝脏作为机体重要的代谢器官，也是外周生物钟系统最重要的组成部分，在调节能量代谢和维持生物体的正常生理功能方面发挥着至关重要的作用。同时，许多植物化学物质已被证明可以通过影响生物钟的振幅或相位等调节生物钟系统，缓解由昼夜节律紊乱引起的代谢综合征。为了研究PIP对HFD诱发昼夜节律紊乱的影响，本实验测定了不同时间点肝脏中生物钟基因Bmal1、Clock、Cry1、Per2、Reverbα和Sirt1的mRNA表达水平，并对数据进行余弦分析（图2、表3）。如表3所示，各组中除HFD组中Per2未呈现出节律性表达（P＞0.05），其他生物钟基因均呈现出节律性表达（P＜0.01）。与ND组相比，HFD诱发了肝脏的昼夜节律紊乱，具体表现为Clock表达的振幅极显著减小且峰值相位出现延迟（P＜0.01），Cry1表达的振幅极显著增大且峰值相位出现提前（P＜0.01），Reverbα表达的峰值相位出现延迟（P＜0.01）。与HFD组相比，PIP组大鼠Clock（P＜0.05）和Per2（P＜0.01）表达的振幅显著增大，Cry1表达的振幅显著减小（P＜0.01），Bmal1、Clock、Cry1和Sirt1的峰值相位出现回复（P＜0.01）。这些结果表明，PIP可以削弱HFD引起的大鼠肝脏生物钟基因表达的昼夜节律紊乱。

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大鼠肝脏脂质代谢物的多元统计分析

为了进一步研究PIP对HFD引起的肝脏脂代谢紊乱的影响，本实验基于脂质组学方法分析了与脂代谢相关的潜在脂质生物标志物的变化。如图3A、B所示，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结果表明，各组内样本聚集较好，组间有所离散，表明HFD和PIP处理都影响了大鼠脂代谢模式。从图3C可以看出，ND vs HFD组存在160 种差异脂质代谢物，HFD vs PIP组存在78 种差异脂质代谢物，ND vs PIP组存在187 种差异脂质代谢物，表明各组之间脂质代谢物存在一定程度的差异。

通过对比两组间P＜0.05、变量重要性预测（VIP）≥1、变化倍数（FC）≥1.5或≤0.67的化合物，生成两组间差异脂质种类聚类热图。如图3D、E所示，与ND组相比，HFD组中26 个代谢物上调和23 个代谢物下调；与HFD组相比，PIP组中34 个代谢物上调和15 个代谢物下调。值得注意的是，PIP可以逆转HFD条件下昼夜节律紊乱引起的差异脂质代谢物水平变化，如图3F、表4所示，PIP下调了HFD引起的TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）和TG（18:0_16:0_18:2）水平变化，上调了溶血磷脂酸（LBPA）（16:0_18:1）、双甲基磷脂酸（BisMePA）（38:8e）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16:0p_22:6）和甲基磷胆碱（MePC）（3 2:4 e）的水平。因此，这些结果表明，L B PA（16:0_18:1）、TG（18:0_16:0_18:2）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）、MePC（32:4e）、TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）可能是PIP发挥降脂作用的潜在生物标志物。

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PIP对大鼠肝脏脂代谢基因昼夜节律的影响

目前的研究表明，长期摄入高脂食物会导致能量摄入和消耗不平衡、扰乱生物钟，导致脂代谢紊乱。江芷晴等的研究表明，在高脂饲喂条件下，肝脏生物钟基因节律性表达异常，肝脏脂肪分解减少，内源性脂肪合成异常增加，脂代谢基因的昼夜节律出现紊乱。本研究采用余弦拟合分析了PIP对HFD条件下肝脏脂代谢基因的昼夜节律的影响，结果如图4、表5所示。与ND组相比，HFD处理诱发了乙酰辅酶A羧化酶（Acc）mRNA表达的节律性表达缺失，PparγmRNA表达的振幅增大（P＜0.01），肉碱棕榈酰转移酶1（Cpt-1）、肝脏X受体α（Lxrα）和腺苷酸激活蛋白激酶（Ampk）mRNA表达的振幅减小（P＜0.01），Pparγ（P＜0.05）、胆固醇调节元件结合蛋白（Srebp-1c）（P＜0.01）mRNA表达的峰值相位出现延迟，CCAAT增强子结合蛋白β（Cebpb）mRNA表达的峰值相位出现提前（P＜0.01），表明HFD诱发了脂代谢相关基因的节律性表达紊乱。与HFD组相比，PIP组中Pparγ、Srebp-1c、Cpt-1和LxrαmRNA表达的振幅趋近ND组（P＜0.01），Fas（P＜0.05）、Pparγ、Srebp-1c和Cebpb（P＜0.01）的峰值相位也出现回复，表明PIP可改善由HFD引起的肝脏脂代谢相关基因昼夜节律的改变，部分恢复机体正常的昼夜节律。

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脂质标志物、生物钟基因和脂质代谢基因之间的相关性分析

采用Spearman相关性分析和方差分析评估生物钟基因表达水平、肝脏中潜在脂质标志物和脂质代谢基因之间的相关性。如图5所示，TG（20:3e_18:1_18:3）、TG（20:2e_18:1_18:2）和TG（18:0_16:0_18:2）与Fas、Pparγ、Acc、Srebp-1c、Sirt1和Cebpb基因的表达水平呈正相关，与Clock、Cpt-1、Ampk、Per2、Bmal1、Lxrα、Cry1和Reverbα基因的表达水平呈负相关。相反，LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）与Fas、Srebp-1c、Sirt1、Acc和Pparγ基因的表达水平呈负相关，与Lxrα、Clock、Reverbα和Bmal1基因的表达水平呈正相关。结果表明生物钟基因在LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）的含量变化中起到重要的作用，而且LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）有可能是PIP调节HFD引起昼夜节律紊乱的重要靶点。

讨论

研究表明，HFD可改变昼夜节律和能量代谢。同时，昼夜节律和新陈代谢之间的相互作用在维持机体的代谢稳态中发挥着重要的作用。本研究通过设置不同的时间点进行取样检测，证明了PIP对肝脏生物钟和脂代谢基因昼夜节律的影响，并探讨了其可能的作用机制。

PIP是黑胡椒中的主要刺激性生物碱成分，在体外和体内实验均显示出显著的降脂活性。Shah等发现，在HFD诱导的雄性SD大鼠中，灌胃剂量为40 mg/kgmb的PIP具有降脂和抗肥胖的功效。Brahmanaidu等发现灌胃不同剂量（20、30 mg/kg mb和40 mg/kgmb）的PIP均能逆转HFD引起的动物体质量增加，改善了血浆和组织中脂质水平，增强了肝脏抗氧化能力，而且存在明显的量效关系。在本研究中，HFD大鼠在长期经口摄入30 mg/kgmbPIP后，其血清TC、TG和LDL-C水平显著降低，此结果与前人的研究结果相一致，证实了PIP能够显著改善HFD大鼠的血脂水平。

随着研究的深入，研究人员发现生物钟系统可参与调控机体的糖脂代谢节律，从而干预与代谢紊乱相关的疾病。已有研究指出，大约1/3的基因在小鼠体内表现出昼夜节律振荡，但是昼夜节律控制的基因在不同组织中的表达水平存在差异，表明昼夜节律的转录过程具有组织特异性。Hans等研究发现肝脏中的脂质代谢基因存在节律振荡，并与肥胖的发展密切相关。在本研究中，HFD条件下大鼠肝脏的脂质代谢基因（Acc、Pparγ、Cpt-1、Lxrα、Ampk、Srebp-1c、Cebpb）的节律性振荡均产生了不同程度的紊乱，表明HFD破坏了肝脏脂质代谢基因表达水平的昼夜节律，这与Hans等的研究结果相一致。有研究指出，Per2基因通过直接调节Pparγ的表达控制脂质代谢。Wang Tao等发现在Per1敲除小鼠中，Pparγ及其与TG合成相关的靶基因振幅出现紊乱，表明机体的脂代谢昼夜节律由内源性生物钟系统驱动。Pparγ和Lxrα可增强肝细胞中的Srebp-1c表达水平，且Srebp-1c可促进Fas和Acc等脂肪酸合成相关基因的转录，在脂肪生成中起着核心作用。在摄入PIP后，HFD大鼠肝脏中Pparγ、Srebp-1c、Cpt-1和Lxrα的节律性近似于ND组，同时肝脏损伤和血脂水平也显著降低，证实PIP通过改善HFD引起的肝脏脂质代谢基因表达水平的昼夜节律紊乱，减少了肝脏损伤并降低了血脂，说明PIP通过调整肝脏脂质代谢基因的节律振荡发挥减肥降脂功效，与川芨素、白藜芦醇、辣椒素等活性物质的降脂机制一致。经过脂质组学分析和相关性分析，发现LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）与脂质代谢基因表达密切相关，这说明上述脂质代谢物可能是PIP调节HFD引起脂质代谢昼夜节律紊乱的重要靶点。这个发现为研究脂质代谢相关基因昼夜节律表达水平的改变对脂质代谢物产生影响的机制奠定了基础。未来仍需进一步探究PIP调控脂质代谢相关基因节律性表达的作用机制。

结论

本研究首先构建了高脂饲料诱发的大鼠肥胖模型，探究了PIP对肥胖大鼠脂代谢昼夜节律的调节作用。实验结果表明，PIP可以减轻HFD诱导的肝脏损伤，降低血脂水平，缓解肝脏生物钟和脂代谢基因表达的昼夜节律紊乱。此外，对大鼠肝脏脂质组学分析，发现PIP处理恢复了HFD引起的TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）、TG（18:0_16:0_18:2）、LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）的水平变化，且LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）与肝脏生物钟基因的表达水平具有显著相关性，表明其可能是PIP通过生物钟基因调节肝脏脂代谢的关键脂质组分。综上所述，PIP作为一种多功能性的植物化学物质，具有调节高能量饮食诱发的脂质代谢昼夜节律紊乱的潜力。在未来研究中，采用特定器官生物钟基因敲除鼠将更有利于阐明PIP调控肝脏脂代谢昼夜节律的作用机制。

本文《基于脂质组学研究胡椒碱对肥胖大鼠脂代谢基因昼夜节律的影响》来源于《食品科学》2024年45卷第09期124-134，作者：张玮芸，HO Chi-Tang，吕慕雯。DOI :10.7506/spkx1002-6630-20230602-015。