大脑是人体最重要也是最复杂的器官之一，它承担着控制身体活动、思维、情感和记忆等多种功能。其复杂的结构和功能，一直是人类科学未曾完全探明的领域。
在学术界，人类前脑中特定脑细胞亚型和谱系关系的解剖学起源仍存争议。前脑发育受形态发生因子和转录因子的控制，介导包括海马体、皮质和基底神经节在内的三维结构的模式。虽然此前已经有使用单细胞病毒条形码进行的研究，但对人类的研究仅限于广泛空间水平上的克隆关系，要想全面理解其结构组织和细胞起源，最有效的方式就是在成熟的人类大脑中进行直接观察。
近日，加州大学圣地亚哥分校医学院神经生物学系、犹他大学Changuk Chung和杨晓旭博士等人在《Nature》上发表了一篇文章，名为《Cell-type-resolved mosaicism reveals clonal dynamics of the human forebrain》。研究人员利用特定细胞类型内的大脑镶嵌变异作为克隆动力学的不同指标，标记特定细胞类型的镶嵌变异条形码用于神经元谱系的来源以及类型分析。（图1）
实验结果中，一方面发现海马体中的局部兴奋性神经元谱系与新脑皮层中的兴奋性神经元或基底神经节中的局部GABA能抑制性神经元存在显著差异；同时在细胞类型特异性和单细胞水平上进行的基因组转录组分析表明，DLX1+抑制性神经元亚群来自背侧新皮层，从与兴奋性神经元共享的起源径向分散；最后，镶嵌变异在一个顶叶内17个位置的分布表明，兴奋性和抑制性神经元前后轴的限制先于背腹轴的限制，揭示控制人类前脑发育的谱系关系，即大脑皮层左右-前后-背腹发育模型。
研究人员提到，人脑中存在合子后的突变产生的马赛克变体，利用马赛克变异条形码分析(MVBA)在成人中的分布可以揭示克隆动力学和可能起源于胚胎发生的谱系关系，但这种方法在处理小细胞群(如皮质抑制性神经元)时面临技术挑战。为了克服这些挑战，作者开发了甲醇固定核分选(MFNS)方案，适用于从合适细胞库制备的高质量完整细胞核中分离出DNA。
通过MFNS获得的多样性，称为细胞类型特异性MVBA（cMVBA）包括三个阶段： (1)组织收集，用于马赛克变异（MV）检测。(2)大块组织穿孔进行300×全基因组测序（WGS），然后进行最佳实践MV调用管道，生成MV候选列表。(3)将来自每个穿孔体组织、MFNS样本或单个细胞核的DNA通过MPAS对MV候选物进行验证和定量。MPAS中验证的MVs的等位基因部分用于确定不同神经元细胞类型的克隆动态，并重建大脑发育特征。用MFNS排序或未排序的皮质核进行单核RNA测序得到投影（UMAP）。基于每个簇中标记物表达和差异表达基因的皮质细胞类型，得到每个已分类的皮质核群体中的细胞类型比例以及检测到的位置分类的MV的数量，只在脑组织中检测到的呈红色。（图2）
在制备的DNA样本，利用筛选出的几种针对抑制性神经元标记的抗体，通过单核RNA测序，进一步证实了细胞类型组成：DLX1+和COUPTFII+多包含抑制性神经元（超过75%），几乎100%的TBR1+被证实为兴奋性神经元。通过一系列分析，进一步证实DLX1+和TBR1+细胞核分别为抑制性和兴奋性神经元。（图3）
随后对荧光分选出的NeuN+单核进行ResolveOME和snMPAS单核基因组-转录组共测序，验证不同细胞群体的谱系关系。通过叠加计算所有嵌合位点在数百个样本中各自不同的比例关系推断细胞谱系的遗传学相似度和早期胚胎发育中的谱系关系。
通过对这些嵌合突变的整体遗传相似度分析，首先发现海马体来源样本的遗传相似度小于大脑皮层与基底神经节。排除神经迁移的影响后，结果表明海马体中细胞独特的细胞谱系结构应来源于内部成体神经发生时的克隆扩增。
MFNS分选方案的作用在于，分选出TBR1+的兴奋性神经元、DLX1+的抑制性神经元、COUPTFII+的来源于腹侧神经节隆起抑制性神经元亚型。再利用MPAS分析发现COUPTFII+标记的来源于腹侧神经节隆起的抑制性神经元亚型彼此之间有极高的相似性，表明其拥有共同来源。同时发现，DLX1+标记的主要抑制性神经元类群与相应脑区的兴奋性神经元类群有更高的遗传相似性。
为了证实实验中所用方法的分选精确度不会影响这个结论，研究人员又通过线性回归模拟计算，得出平均60%的抑制性中间神经元来源于背侧的结果，这是导致整体DLX1+抑制性神经元在每个脑区内都与对应的兴奋性神经元有较高的遗传相似度的原因。（图4）
研究表明，大多的皮层细胞表现出分散的克隆动力学，而不是纯粹的径向分布，同时证实了整个大脑皮层上来源于神经节隆起的迁移细胞相互独立并且彼此遗传特征高度相似。最后，作者还强调了进一步研究皮质抑制神经元多样性的必要性。
