2024年4月25日最新一期《Nature》封面，是一张无人机照片。上面画着类似于神经元生长的冰图案，封面所示与本周期刊中的一篇研究论文有关。（图1）
蒂莫西综合征（TS/TS1）是一种罕见的遗传性疾病，以心脏缺陷、自闭症和癫痫为特征，由编码钙离子通道的基因CACNA1C突变引起。
美国斯坦福大学John Huguenard & Sergiu P. Pașca等人在本周《Nature》上发布了一篇名为《Antisense oligonucleotide therapeutic approach for Timothy syndrome》的文章，提出修正这一突变所致缺陷并治疗这种疾病的潜在策略。团队开发的反义寡核苷酸（ASO）能减少该基因对携带突变的蛋白质编码序列的使用，更多地使用另一序列。他们随后在3D组织模型——从取自蒂莫西综合征患者的干细胞获得的皮质类器官和前脑类组装体——中测试了这种策略。通过测试后，团队将这些类器官移植到新生大鼠的脑皮质中，证明了反义寡核苷酸疗法修正了该基因缺陷导致的钙和神经细胞结构性问题。（图2）
一、外显子8A的增强导致神经元功能异常
外显子 8 和 8A是 CACNA1C 基因互斥的 104 个核苷酸长的外显子。外显子8A在皮层分化早期的表达水平较高，随着时间的推移，外显子8的表达逐渐显出优势。在分化的第60-90天，来自TS1患者表达的外显子8A水平明显高于对照，限制性片段长度多态性分析(RFLP)进一步证实了这一发现。表明G406R的突变可能直接干扰剪接并增强其自身包含的8A的表达，结果是通过延长突变CaV1.2的表达来放大疾病表型。（图3）
研究人员分析了TS人皮层类器官 （hCO）中的mRNA组成，通过对互补DNA的扩增测序，发现TS样品中外显子8A表达升高的主要包含p.G406R等位基因。又生成了两个小基因剪接报告基因(横跨外显子8和8A) ，分别转染和扩增HEK293T细胞后，发现TS突变足以使CACNA1C剪接偏向外显子8A，而不受细胞环境的影响。（图4）
先前的研究发现，剪接主调控因子PTBP1调节小鼠 CACNA1C 15的外显子8和8A剪接。类器官和人脑初级RNA测序数据均显示，PTBP1的表达随着时间的推移而降低。研究人员探索了PTBP1在CACNA1C剪接中的作用，通过转染存在或不存在人类PTBP1的CACNA1C小基因剪接报告基因，发现在添加PTBP1后，剪接模式发生了显著变化，并且含有外显子8a的转录本也增加了。综上所述，这些实验表明，TS外显子8A CACNA1C变体可能通过干扰剪接机制，直接并持续地增强其自身的丰度，剪接调节因子PTBP1影响外显子8与8A的选择。
二、减少外显子8A的反义寡核苷酸（ASO）策略
为了筛选能够修饰外显子8剪接的ASO，研究人员设计了一个5个核苷酸(nt)间隔覆盖外显子8A的“ASO行走”策略，使用具有通用2 '-O-甲氧基乙基核糖(MOE)修饰的ASOs。二维神经培养结果显示，几种ASO诱导了外显子8A的强烈下调，但外显子8的表达没有改变。这一现象在三维hCO中亦得到了验证。对这些扩增子进行测序进一步证实，ASO（ASO.14、ASO.17 和 ASO.18 ）靶向并下调了来自3例TS患者的hCO外显子8A。这些影响是持久的，暴露后90天内，单次给药ASO可有效抑制外显子8A。此外，hCO免疫印迹显示，从8A到8的转换与CaV1.2蛋白总量的变化无关。
接着研究这些ASOs的药效学，研究人员在分化第30和90天用不同浓度的ASO.14处理hCO。观察到外显子8A表达的剂量依赖性降低。RT-qPCR分析，发现在体外ASO暴露1h后就改变了外显子8A的表达。ASO.17和ASO.18的药效学与ASO.14相似。随后探究ASOs的渗透效果，用流式细胞术定量发现可以渗透大多数细胞。研究表明人类神经元摄取ASO，并能在短时间内以剂量依赖的方式降低TS模型外显子8A的表达。
此外，为了确定ASO对人类神经细胞的不良影响，研究人员还测量了它们的毒性、免疫原性和脱靶效应。这些评估ASO体外不良反应的初步结果与先前关于ASO毒性和脱靶的研究一致。（图5）
三、体外ASO效应
在此之前，研究团队已证明，TS皮质神经元表现出钡电流的延迟失活，去极化后细胞内钙增加，神经元间迁移受损。研究人员检测了细胞表型所需的TS CaV1.2表达阈值，发现即使很小比例的TS CaV1.2也足以扰乱通道失活的动力学，进一步表明ASO的治疗潜力。
接着测试了通过ASOs改变外显子8A/8剪接是否可以恢复CaV1.2通道功能。将TS hCO神经元暴露于ASOs中，与hCO神经元对照。Fura-2 AM钙成像试验中，TS神经元在去极化后表现出更慢的衰减动力学。所有三种选择的ASOs都将残余钙恢复到控制水平，这表明ASOs可以功能性地挽救TS CaV1.2通道。通过测量电流箝位2s后通道失活百分比，TS神经元显示出钡电流的延迟失活，但缺陷通过ASO.14和ASO.17得以修复。又在游离的hCO神经元上建立了可扩展的GCaMP6f成像读数，进一步探索ASO的挽救功能。结果表明 TS 挽救的 RNA 表达水平和蛋白质功能之间可能存在差异。（图6）
此前研究人员已经发现，TS中间神经元存在迁移异常。接着开始研究ASOs是否可以在三维培养中纠正这种细胞迁移缺陷，将TS与人皮层类器官 （hCO） 和人苍白下类器官 （hSO）对照，用谱系特异性报告基因标记了hSO中的中间神经元，并生成了人前脑集合体 （hFA）。ASO暴露前的基线，跳跃频率增加，与对照中间神经元相比，TS中间神经元的跳跃长度缩短。暴露于ASO.14和ASO.17后，降低了TS中间神经元的跳跃频率，跃变长度增加。总结出，ASOs可以有效地挽救TS患者体外培养的通道功能、钙信号动力学和细胞表型。（图7）
四、体内ASO递送
体外结果表征良好，接下来在体内环境验证效果。研究人员开发了一种移植到早期出生大鼠发育中的大脑皮层的策略，使hCO能够发育出成熟的细胞类型，并在解剖学和功能上整合到啮齿动物的大脑。
首先在大鼠中测试ASO的效应，发现 ASO.14 的确可以降低了皮层、小脑和脊髓中CACNA1C外显子 8A 的表达。接着，研究人员从三个TS患者身上移植了hCO，并通过磁共振成像（MRI）和免疫染色监测hCO和移植物位置。将ASO.14注射到大鼠蓄水池中，一段时间后发现 TS t-hCO 中的CACNA1C外显子 8A 降低了表达水平。与体外 ASO 实验类似，总体 CaV1.2 水平不受影响。该实验表明，ASOs可以鞘内递送，并能有效调节人移植细胞的剪接。
最后，研究人员试图验证 ASO 给药对 TS1 突变导致的细胞功能障碍的影响。使用钙指示剂 Calbryte 520 AM 进行离体钙成像，发现 ASO.14 使皮质 TS 神经元中的钙增加正常化。为了测试 ASO 是否可以挽救与TS有关的活性依赖性枝晶形态缺陷，研究人员在 ASO 注射后 14 天使用 t-hCO 中的高尔基体染色追踪神经元，发现ASO.14纠正了体内TS神经元的树突形态。这些实验表明，ASOs可以在体外和体内调节人类CACNA1C的剪接，从而挽救TS1的分子和细胞表型。（图8）
在这项研究中，开发了一种潜在的治疗策略，用于治疗由可变剪接外显子中的单核苷酸变异引起的严重神经发育障碍。研究人员提到，项目中包含的概念验证研究，包括体外和体内研究与人类患者衍生的三维多细胞模型的结合，说明了团队之前开发的类器官移植平台可以用于研究其他神经精神疾病，并评估治疗效率和安全性，包括但不限于 ASO、病毒载体和小分子。当动物模型不可用或不能完全概括人类病理生理学时，这一点便显示出了优势。
ASO使用了这一平台在体内递送，证实可以挽救整合到大鼠大脑皮层中的人类神经元中的剪接和细胞内钙通量缺陷。
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07310-6
