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INTRODUCTION
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研究介绍
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研究背景
Background
随着精准医疗领域的革命性进展，临床上可操作和病原性的基因突变的识别已经取得了巨大的进步。然而，在已报告的7.87亿个基因变异中，只有不到0.5%的变异在ClinVar数据库中有临床解释。由于大多数变异是罕见或特定于特定人群的，使用全基因组关联研究或计算方法来预测其功能影响变得特别具有挑战性。此外，基因变异的共现进一步复杂了现有计算方法的解释。在这些情况下，全基因组关联研究难以准确确定个体变异是病原性的还是仅仅作为乘客突变共遗传的。这种情况下，亟需在基因编辑领域开发工具，以便在相同的基因背景下建模多个基因变异组合，从而分解多基因障碍、意义不明确的变异组合、单倍型块中遗传的变异或在相同生物通路中修饰基因内的变异的临床贡献 。
2024年5月21日，加州大学圣地亚哥分校Alexis Komor教授团队在《NatureBiotechnology 》上发表了相关研究的最新文章。
研究意义
Significance
本研究开发了一种多重正交碱基编辑系统（MOBE），该系统通过使用RNA适配体-外壳蛋白系统将DNA修饰酶直接招募到导向RNA，从而实现了腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器的正交多重化。MOBE系统能够在不同的原位上同时引入C·G到T·A和A·T到G·C的单核苷酸变异，具有较高的精确度和编辑效率。通过荧光富集策略，MOBE系统在多种细胞类型中实现了高达24.8%的同时编辑率。这一系统不仅兼容扩展的原位旁邻基序和高保真Cas9变体，还在多个细胞类型中表现良好，且与其原始系统相比具有相同或更低的脱靶倾向。MOBE系统的开发为研究多基因障碍、意义不明确的变异组合以及疾病相关的点突变组合提供了新的工具。
METHODS
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研究方法
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RNA适配体技术
利用RNA适配体-外壳蛋白系统，将DNA修饰酶直接招募到导向RNA上。这一方法用于设计和优化腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE），确保它们能够在不同位点同时进行编辑，避免交叉编辑的问题 。
荧光报告基因系统
设计了一个包含双死GFP基因的荧光报告系统，用于检测和富集高编辑效率的细胞。通过荧光活性细胞分选（FACS），提高了编辑效率，并确保了编辑的准确性 。
次世代测序（NGS）
通过NGS技术，对编辑效率和精确度进行了量化分析。NGS数据用于评估目标位点的编辑效率、交叉编辑率以及插入/缺失（Indel）率。
FINDINGS
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研究发现
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多重正交碱基编辑系统（MOBE）的设计与实现
图1
图a概述了碱基编辑的基本原理，以胞嘧啶碱基编辑器（CBE）为例，说明如何通过导向RNA（gRNA）和催化失活的Cas9（nCas9）形成R-loop结构，暴露出一个小窗口以进行精准的碱基修改。接着，图b展示了同时使用CBE和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）进行多重编辑时，因gRNA交叉绑定导致的非正交编辑问题。图c则示意了这种交叉编辑可能带来的多种基因型变化。最后，图d提出了利用正交适配体-外壳蛋白系统解决交叉编辑问题的方法，通过将脱氨酶直接招募到各自的gRNA上，实现特定位置的C·G到T·A和A·T到G·C编辑，确保了编辑的特异性和精确性。这些图示展示了MOBE系统如何通过创新设计，实现高效、精准的多重正交碱基编辑，为复杂基因变异的研究提供了新的工具。（图1）
2
腺嘌呤碱基编辑器（ABE）适配体系统的工程化
研究人员通过设计和测试多种gRNA适配体和脱氨酶融合蛋白组合，显著提高了ABE的编辑效率。首先，实验展示了初始设计的ABE适配体系统在编辑效率上的低效和可变性。随后，通过采用进化的脱氨酶TadA8e和TadA8.20，研究团队成功优化了ABE适配体系统，实现了较高的A·T到G·C编辑效率。最终，图展示了多个适配体-脱氨酶组合在不同基因位点的编辑效果，证明了这些优化系统在提高编辑效率和精确度方面的显著改进 。（图2）
图2
3
胞嘧啶碱基编辑器（CBE）适配体系统的工程化
研究人员通过设计和测试多种gRNA适配体和脱氨酶融合蛋白组合，显著提高了CBE的编辑效率。首先，图a概述了嵌入适配体的gRNA和脱氨酶-外壳蛋白（CP）融合蛋白的构建。图b和图c分别展示了在HEK3和RNF2基因座上，使用evoAPOBEC1脱氨酶和MS2适配体-CP系统的CBE适配体系统的编辑效率。实验结果显示，前七种构建体在目标胞嘧啶的C·G到T·A编辑效率最高。图3d展示了在五个基因座（HEK3、EMX1、RNF2、HEK2和HIRA）上，相对于父本evoBE4编辑器，前七种CBE适配体系统的相对编辑效率。最终，图e示意了两个最有效的适配体嵌入gRNA和脱氨酶-CP融合蛋白构建体（apt-CBE-3′-end和apt-CBE-SL3），这些构建体在所有测试位点上表现出一致的高编辑效率 。（图3）
图3
4
对优化后的CBE和ABE适配体系统进行了表征
研究人员在HEK293T细胞中对四种优化的适配体系统和各自的父本编辑器在73个胞嘧啶和112个腺嘌呤上的编辑效率进行了测量，这些靶点分布在15个不同的基因组原位上。图a和b展示了目标胞嘧啶和腺嘌呤在原位内各位置的编辑效率，并根据其前5′碱基的不同进行颜色区分。实验结果显示，所有四种适配体系统的编辑窗口略窄于其父本编辑器。图c和d则将每种适配体系统的最高编辑效率标准化为其父本编辑器，结果表明，适配体系统在所有15个原位中的编辑效率具有一致性和高效性。（图4）
图4
5
MOBE和BE在同时使用CBE和ABE时的分析
研究人员设计了四种MOBE系统，每种系统结合了优化后的CBE和ABE适配体。通过在HEK293T细胞中进行实验，结果表明MOBE系统在目标位点的编辑效率显著提高，且交叉编辑显著降低。具体来说，MOBE1系统在HIRA.0/HEK3.0位点的C·G到T·A转换效率为21.8%，A·T到G·C转换效率为36.2%。相比之下，其父本evoBE4/ABE8e系统分别为16.8%和49.0%。MOBE系统的交叉编辑率明显低于父本系统，MOBE3系统在所有原位上的交叉编辑平均仅为1.0%，而evoBE4/ABE8e系统的交叉编辑率高达30.2%。这些结果展示了MOBE系统在多重正交编辑中的高效性和低交叉性，为精确基因编辑提供了新的工具 。（图5）
图5
6
利用荧光报告基因系统增强MOBE效率
研究人员设计了一个包含双死GFP基因的报告系统，当MOBE系统成功执行A·T到G·C和C·G到T·A编辑时，会恢复GFP的荧光。HEK293T细胞被转染了MOBE系统、目标gRNA和报告质粒。通过荧光活性细胞分选（FACS），富集了高编辑效率的细胞。结果显示，MOBE1系统在六个原位组合中平均达到了40.0%的C·G到T·A和55.7%的A·T到G·C编辑效率，最高达到81.5%。富集细胞的编辑效率显著高于未富集细胞，且富集策略未降低正交性。实验还发现，MOBE系统的插入/缺失（Indel）率较低，确保了编辑的精确性和安全性 。（图6）
图6
DISCUSSION
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研究讨论
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本文开发了多重正交碱基编辑系统（MOBE），展示了在多个基因位点同时引入单核苷酸变异的高效和精确能力。研究发现MOBE系统能够在不同的细胞类型中实现高达24.8%的精确共现编辑率，并且具有较低的脱靶效应，这为研究多基因障碍和疾病相关的点突变组合提供了新的工具。研究展示了如何通过分子生物学技术和基因编辑工具的创新组合，实现复杂的基因编辑任务，从而推进精准医疗的发展。
尽管研究成果显著，但本文也有一些局限性。首先，虽然MOBE系统展示了较高的编辑效率，但在某些目标位点上的效率仍有提升空间。此外，尽管脱靶效应较低，但在临床应用前，还需要进一步验证其在体内的安全性和稳定性。最后，该系统的复杂性可能对实验室的普及和应用带来一定的挑战。
参考文献
[1] Cowan, Q.T., Gu, S., Gu, W. et al. Development of multiplexed orthogonal base editor (MOBE) systems. Nat Biotechnol (2024).https://doi.org/10.1038/s41587-024-02240-0
[2] A New Gene-Editing System Tackles Complex Diseases (https://today.ucsd.edu/story/mobes)
PROFILE
Quinn T. Cowan
Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA
“我们正在将质粒放在 AddGene 上，以便任何人都可以自由访问它们。我们希望其他研究人员能够使用 MOBE 来模拟遗传疾病，了解它们的表现，然后希望创造出有效的疗法，”Cowan 说。
END
文案 | 贺卫军
排版 | 贺卫军
审核 | 夏诞
发布｜姜笑南
世界生命科学大会
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