Nature Com.| 单步CRISPR检测：15分钟内精准检测猴痘病毒_

INTRODUCTION

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研究介绍

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研究背景

Background

自2022年猴痘病毒(MPXV)爆发以来，全球116个国家和地区向世界卫生组织(WHO)报告了超过90,000例病例，猴痘已被列为“国际关注的突发公共卫生事件”。

猴痘是一种病毒性人畜共患病，症状包括发热、头痛、肌肉酸痛、背痛、淋巴结肿大和皮疹。尽管大多数患者在几周内恢复，但部分患者可能会严重恶化甚至死亡。目前的检测方法主要是实验室检测，如实时定量聚合酶链反应(qPCR)，但这些方法需要昂贵的设备和专业技术人员，在资源有限的地区难以普及。

因此，开发一种高效、便捷和快速的检测方法变得尤为重要。

近日，王升启等团队在《Nature Communications》发表论文：“Ultrasensitive single-step CRISPR detection of monkeypox virus in minutes with a vest-pocket diagnostic device”，共同开发了一个基于CRISPR技术的诊断平台，用于快速、灵敏地检测猴痘病毒。

研究涉及多个步骤，包括病毒裂解、单步重组酶聚合酶扩增-CRISPR反应和结果解读，并采用一个便携式分析设备来执行整个过程。这项研究在全球公共卫生领域具有重要意义，特别是对于资源有限的环境中的现场快速诊断。

研究目的

Objectives

开发一种基于CRISPR的单步检测平台SCOPE（Streamlined CRISPR On Pod Evaluation），以便在资源有限的现场环境中实现对猴痘病毒的超灵敏检测。该平台通过简化病毒裂解步骤，在2分钟内从皮疹液、口腔拭子、唾液和尿液样本中快速释放病毒核酸，随后进行10分钟的单步重组酶聚合酶扩增(RPA)-CRISPR/Cas13a反应，实现快速检测。

METHODS

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研究要点

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研究过程

Sampling

平台设计与工作流程

SCOPE平台采用了一种简化的病毒裂解协议，仅需2分钟即可从皮疹液、口腔拭子、唾液和尿液样本中释放病毒核酸。随后，通过10分钟的单步RPA-CRISPR/Cas13a反应检测猴痘病毒。

该反应将重组酶聚合酶扩增（RPA）、T7转录和CRISPR/Cas13a反应整合在一个管中进行，通过CRISPR/Cas13a的转切割特性实现目标核酸的高效检测。整个过程可以在便携式设备CPod上完成，该设备集成了反应执行、信号采集和结果解释功能。

图1 使用SCOPE对病毒进行即时检测

设备特点

便携式设备CPod设计紧凑，成本低，不需要复杂的设备，非常适合资源有限的现场环境。CPod通过蓝色LED和光谱传感器采集荧光信号，能够实现实时的检测和结果解读。

图2 单步RPA-CRISPR/Cas13a检测系统基本组件优化

图3 免提取病毒裂解的优化

设备设计的核心是一个低成本的小型光谱传感器，而不是传统的光学滤光片，极大地降低了设备成本。用户可以通过CPod上的指示灯直接读取结果，或者通过无线连接到智能手机应用程序获取实时荧光曲线和结果解释。

图4 便携式CPod设备的内部结构和外部设计

检测性能

在102个临床样本中的验证结果显示，SCOPE平台的检测结果与实时PCR完全一致，灵敏度和特异性均达到100%。该平台可检测到低至0.5拷贝/µL的猴痘病毒，灵敏度与PCR检测相当。为了验证平台的灵敏度和重复性，研究团队在不同浓度的猴痘病毒DNA上重复进行了20次独立实验，结果表明检测的最低限度为0.5拷贝/µL，且没有交叉反应。

图5 SCOPE分析性能的评估

临床样本验证

研究团队使用35例猴痘阳性样本、19例单纯疱疹病毒样本和48例健康男性的阴性样本进行了验证，结果显示SCOPE平台在检测猴痘病毒方面表现出100%的灵敏度和特异性，与qPCR检测完全一致。

检测步骤包括样本裂解、单步CRISPR反应和结果读取，整个过程在15分钟内完成，显著减少了操作步骤和时间。

图6 SCOPE平台的临床样本适用性检测

FINDINGS

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研究亮点

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1、快速高效：SCOPE平台能够在15分钟内完成从样本输入到结果输出的全过程，显著缩短了检测时间。

2、便携性：便携式设备CPod小巧且成本低，不需要复杂的设备，适用于资源有限的现场环境。

3、超高灵敏度：该平台可检测到低至0.5拷贝/µL的病毒浓度，具有与PCR检测相当的灵敏度。

4、应用广泛：SCOPE平台可用于检测多种样本类型，包括皮疹液、口腔拭子、唾液和尿液，适用于多种现场检测需求。

DISCUSSION

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研究结论

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SCOPE平台通过简化的操作流程和便携式设备，实现了快速、灵敏和便捷的猴痘病毒检测，适用于资源有限的现场环境。这一研究有望推动CRISPR诊断技术在现场检测中的实际应用。

参考文献

Wang, Y., Chen, H., Lin, K. et al. Ultrasensitive single-step CRISPR detection of monkeypox virus in minutes with a vest-pocket diagnostic device. Nat Commun 15, 3279 (2024).https://doi.org/10.1038/s41467-024-47518-8

PROFILE

王升启

王升启，任职于中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所生物技术研究室，主任，研究员，博士生导师。

主要研究领域为：生物芯片或中药现代化、基因芯片技术研究和开发、反义技术和反义药物、中药基因组学和化学组学研究等