研究介绍
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研究背景
Background
骨骼是动态组织，提供保护、支撑和运动功能，同时维持矿物质平衡和造血相关功能。骨质疏松症是由于骨生成和脂肪生成失衡导致骨量减少的疾病。营养饮食中的因素如钙、维生素D、脂类和辅酶Q10等均影响骨质疏松症的形成。
益生菌对人体有益，包括增加抵抗力、降血脂、刺激免疫系统、控制体重、改善能量代谢、增加胰岛素敏感性等。某些益生菌如双歧杆菌和乳酸菌显示出抗肥胖效果，可能有助于骨质疏松症。骨髓脂肪组织扩张和脂毒性是骨质流失的重要原因，益生菌可能通过影响血液中的化合物来预防骨龄疾病，如骨质疏松症。
研究目的
Objectives
研究旨在评估制备的新型益生菌提取物(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KUMS Y33)对人类脂肪来源干细胞(hADSCs)向脂肪细胞和成骨细胞的分化过程的影响，通过研究特定的分子标记物，澄清其在预防和治疗骨质疏松症中的作用，这是一个过去较少涉及的新课题。
研究方法
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研究亮点
1、从传统酸奶中分离出多种细菌进行评估，以表征益生菌的活性/适用性。
研究从伊朗西部克尔曼沙省不同地区采集的70份传统发酵酸奶样品中分离出多种细菌菌株，通过在MRS培养基中培养并在模拟胃肠道条件下评估其存活率和耐受性。随后，通过胆固醇吸收能力、细胞附着性、抗病原活性、抗生素敏感性等试验评估这些菌株的益生菌特性。此外，细菌菌株的安全特性也得到评估，包括溶血活性和潜在毒力基因检测。这些步骤为深入了解这些细菌的益生菌活性和适用性提供了重要信息。
2、细菌鉴定及提取物制备
使用特定引物提取细菌基因组DNA，并通过PCR循环扩增，随后将扩增和纯化的DNA进行测序，并与NCBI和GenBank中的序列比对进行细菌菌株鉴定。接着，在MRS肉汤中培养细菌菌株，分离细菌提取物后调整pH并过滤，以准备用于细胞分化测定。
3、在该研究中，从脂肪抽吸组织中分离出脂肪干细胞（ADSCs），这些细胞被视为一种多能干细胞的重要来源。提取过程包括酶消化和离心，最终将细胞培养至第四代。随后进行免疫表型分析，通过检测CD73、CD105、CD29、CD34和CD45等标记物，确认其为MSCs。接着进行多能性实验，将ADSCs分化为软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞，培养一定时间后通过染色确认其分化状态。
4、分离的人类脂肪干细胞（hADSCs）以益生菌提取物进行处理，然后诱导成骨和成脂。为了评估分化过程，进行了Oil Red O和Alizarin Red染色、甘油三酯含量测定、碱性磷酸酶（ALP）活性测定，以及成骨细胞和成脂细胞特异基因的实时PCR和Western blot分析。最终，新菌株被测序并在NBCI上注册。
研究发现
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基本信息描述
1、Y33菌株展现出在模拟胃肠道条件下的高存活率 (图1)，突出的胆固醇吸收能力 (图2)，显著的附着能力以及自聚集和共聚集能力(图2)，强大的抗病原活性(图3)，较高的抗生素敏感性(图4)，无溶血活性，以及通过16S-rRNA基因测序准确鉴定的特点。这些特性使其成为潜在优秀的益生菌菌株，有望在促进肠道健康、维持微生态平衡和提高免疫力方面发挥重要作用。
图1：在pH 2.5下孵育3小时和在0.3%胆盐下孵育4小时后，分离的LAB的存活率（%）。所示数值为均值±标准偏差（n=3）。*带有相同字母的数值没有显著差异（P
图2：在胃和肠消化条件下的存活率（%），胆固醇摄取量，表面疏水性，附着能力，自聚集（%），共聚集（%）以及分离的LAB的溶血活性。所示数值为均值±标准偏差（n=3）。*带有相同字母的数值没有显著差异（P
图3：分离的LAB菌株对病原体的抑制效果。所示数值为均值±标准偏差（n=3）。*数值为三次重复的均值±标准误差。S（强 r≥20 mm），M（中等 r10 mm），W（弱 ≤10 mm)。
图4：分离乳酸菌的抗生素敏感性概况抗生素敏感性谱。红霉素结果基于 R≤13 mm；I：13–23 mm；S≥23 mm。庆大霉素结果基于 R≤6 mm；I：7–9 mm；S≥10 mm。万古霉素结果基于 R≤12 mm；I：12–13 mm；S≥13 mm。I：中间（区直径，12.5–17.4 mm）；R：耐药（区直径，≤12.4 mm）；S：敏感（区直径，≥17.5）。V 万古霉素，S 链霉素，K 卡那霉素，TE 四环素，E 红霉素，AM 氨苄青霉素，CC 林可霉素，C 氯霉素，CN 头孢噻肟，GM 庆大霉素。*数值为三次重复的均值±标准误差。a–e 同一行中具有不同小写字母的均值显著不同（P
2、流式细胞术分析(图5)显示出MSC阳性标记物CD105(97 ± 1.2％)、CD73(95 ± 1.1％)和CD29 (94 ± 0.8)高表达，以及阴性标记物CD45(2.2±0.1％)和CD34(5.2±0.4％) 低表达。阿尔西安蓝、茜素红和油红O染色结果表明ADSCs成功分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞(图6)。因此，根据ISCT75标准，这些分离的细胞在表型上属于AD-MSCs。
图5：流式细胞术鉴定 ADSC
图6：ADSCs的三系分化。显微镜图像下的白色条纹等于1000 µm。ADSCs成功分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。因此，根据ISCT标准，分离的细胞在表型上属于AD-MSCs。
3、这项研究发现一种新型益生菌提取物(Y33)对人类脂肪来源间充质干细胞具有显著影响。实验证明，该提取物能够增强成骨分化过程，表现为显著增加ALP活性(图7)、提高RUNX2和骨钙蛋白表达水平，并促进胶原I和FGF-23的上调，通过BMP2/RUNX2信号通路促进成骨分化(图8)。同时，该益生菌提取物也显示出抑制脂肪生成的效果，降低脂质积累，减少C/EBP-α和PPAR-γ2的表达水平，从而预防肥胖(图9)。这些发现为该益生菌提取物在预防和治疗骨质疏松症以及肥胖相关疾病中的潜在应用提供了有力的证据
图7：Alizarin Red staining(A)和碱性磷酸酶活性(B)受到提取物处理的组。显微镜图像下的白色条纹等于1000 µm。**P
图8:(A) Red Oil O染色和(B) 受到提取物处理的组的甘油三酯含量。显微镜图像下的白色条纹等于1000 µm。****P
图9：(A) 受处理组脂肪生成和骨生成标记物的qRT-PCR。脂肪生成标记物（B）和骨生成标记物（C）的Western blot检测。图中B和C部分的blot图已裁剪，以便更好地进行比较。*P
研究讨论
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研究创新性
这项研究的创新之处在于使用一种前所未分离的新型益生菌提取物，成功防止了骨髓中脂肪组织的积累，从而预防骨质疏松症。与以往研究不同的是，该研究对人类脂肪来源间充质干细胞进行了实验，这些干细胞具有多向分化能力。此外，相较于以往研究仅关注骨生成或脂肪生成过程，该研究同时探究了新型益生菌提取物对这两个过程的影响，为治疗骨质疏松症的特性提供了更全面的了解。
研究局限性
结果表明这种新型益生菌提取物可以抑制脂肪生成并显著增加骨生成，对预防和治疗骨老化，包括骨质疏松症具有积极作用，但人体内复杂系统的总体影响尚不清楚，且尚无法确定提取物中哪种化合物影响这些趋势。因此，需要进行更多的体内研究以验证其效果。
对于从乳制品中分离的乳酸菌株，16S-rRNA基因测序虽然被证明是一种有效、低成本和快速的鉴定和区分乳酸菌株的替代方法，但仍需要进一步研究来充分理解潜在机制和确认这些发现的有效性。
PROFILE
Farjam Goudarzi
克尔曼沙阿医科大学再生医学研究中心, 伊朗
参考文献
[1] Goudarzi, F., Kiani, A., Nami, Y. et al. Potential probiotic Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KUMS-Y33 suppresses adipogenesis and promotes osteogenesis in human adipose-derived mesenchymal stem cell. Sci Rep 14, 9689 (2024).https://doi.org/10.1038/s41598-024-60061-2
END
文案 | Alison
排版 | Alison
审核 | Alison
发布｜姜笑南
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