进展汇编：近期应用国产成像技术fMOST的14篇重要学术成果
沃亿生物
前言
骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的荧光显微光学切片断层成像系列技术（fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography，fMOST）作为介观尺度最精细的三维成像技术，伴随着各种标记技术和数据处理技术的发展，现已在神经机制研究、脑疾病研究、心血管疾病研究以及病理毒理等领域得到广泛应用。
近半年来，应用fMOST技术的学术研究硕果累累，并刊登在Nature Neuroscience、Advanced Science、Nature Communications、PNAS等多篇知名国际期刊上。小编精心整理了其中14篇典型应用文章，包含神经图谱研究、阿尔茨海默症研究、新颖标志物全脑成像、多组织器官成像、功能成像联用，供学术分享。
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2022年3月31日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心与MOST团队合作在期刊以封面文章的形式在线发表了题为Nature NeuroscienceSingle-neuron projectome of mouse prefrontal cortex的研究论文。该研究在国际介观图谱领域率先重构了小鼠前额叶皮层6357个单神经元全脑投射图谱，建立了国际上最大的小鼠全脑介观神经联接图谱数据库；首次发现小鼠前额叶皮层中存在64类神经元投射亚型，揭示了其空间分布规律，阐明了前额叶内部模块化的连接网络和等级结构、神经元转录组亚型与投射亚型的对应关系，从而揭示了前额叶皮层内部连接和外部投射的规律，并提出了前额叶皮层可能的工作模型。该研究不仅为深入研究高级认知功能的神经机制奠定了结构基础，也为研究全脑介观神经联接图谱提供了重要的技术支撑。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41593-022-01041-5
2022年9月26日，MOST团队在期刊在线发表了研究论文PNASDissection of the long-range projections of specific neurons at the synaptic level in the whole mouse brain，该研究通过特殊设计的AAV病毒(AAV2/9-hSyn-flex-tdTomato-T2A-synaptophysin-EGFP-WPRE-pA）实现轴突与突触前结构共标记，在正常与阿尔兹海默症（AD）模型鼠中分别解析了基底前脑神经元的长程投射模式，解决了全脑高分辨率数据集获取与分析中样本制备等环节的技术难点，实现了多种荧光蛋白的微弱信号保持。利用fMOST以0.23 μm × 0.23 μm × 1 μm体素分辨率获取了全脑连续数据集，分析了神经环路的投射模式和关键脑区内突触前结构的分布规律。
该研究建立了在突触水平解析特定类型神经元长程投射模式的研究方法，绘制了基底前脑PV神经元带有突触信息的全脑投射图谱，并探究了其在AD的退行变化，为解析生理和病理条件下特定类型神经元全脑突触连接模式提供了新的思路。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2202536119
2022年8月19日，MOST团队在期刊发表题为Neuroscience BulletinWhole‑Brain Connectome of GABAergic Neurons in the Mouse Zona Incerta的研究论文。未定带（Zona incerta, ZI）是外侧下丘脑中的一个以抑制性GABA能神经元为主的脑区，该研究利用嗜神经病毒环路示踪工具和Vgat-ires-Cre转基因小鼠分别标记其中的GABA能神经元的输入神经元胞体和投射纤维，并采用fMOST绘制了ZI的GABA能神经元的全脑输入和输出图谱，比较了不同亚区之间输入以及输出，阐述了ZI与主要连接脑区之间的连接模式。该研究为ZI的功能研究建立了解剖学数据集和参考图谱，也从新的视角解析了脑的环路组织规律。
原文链接：https://doi.org/10.1007/s12264-022-00930-w
初级听觉皮层（primary auditory area, AUDp）是大脑听觉皮层中处理声音信息的关键区域。然而，对AUDp中特定类型神经元在全脑范围内长程联接模式的全面认识仍然缺乏。2022年3月21日MOST团队在期刊上发表题为Neuroscience BulletinWhole-Brain Direct Inputs to and Axonal Projections from Excitatory and Inhibitory Neurons in the Mouse Primary Auditory Area的研究论文。本研究采用dfMOST结合Cre转基因小鼠及病毒示踪技术，在亚微米分辨率水平获取了AUDp中兴奋型和抑制型神经元的全脑输入输出三维连续数据集。为了更加准确地阐明AUDp中特定类型神经元的直接输入和轴突投射的规律，该研究建立了全脑输入输出神经环路的自动化分析流程，通过对上游神经元胞体及下游轴突投射信号的自动识别和分割，及将整个数据集配准到统一的坐标体系中，实现了对AUDp输入输出环路在三维空间内的定量解析，这为进一步探究其生理功能提供了新的见解。
原文链接：https://doi.org/10.1007/s12264-022-00838-5
2022年4月19日，中科院上海药物所MOST及图像融合分析技术服务部与临港实验室科研人员合作在杂志上发表了题为Frontiers in NeuroscienceHigh-Resolution Digital Panorama of Multiple Structures in Whole Brain of Alzheimer's Disease Mice的研究论文。该研究对基于MOST系统获得的全脑Nissl染色数据集，设计出针对相邻灰度区间内多种结构元素的信息提取及重建策略，首次实现了基于Nissl染色的小鼠全脑Aβ斑块分布可视化，在同一小鼠全脑中构建了Aβ斑块及其周围胞体、神经树突、神经束和血管的高精度全景图。研究成果为深入理解AD相关病理状态下的大脑解剖结构特征提供了新思路。
原文链接：https://doi.org/10.3389/fnins.2022.870520
2022年5月7日，在线刊登了MOST团队题为Chemical Engineering JournalAIE-based fluorescent micro-optical sectioning tomography for automatic 3D mapping of β-amyloid plaques in Tg mouse whole brain的研究论文。研究人员报道了一种水溶性荧光探针AIEgens，该探针可在1 min内快速渗透小鼠脑组织并将Aβ斑块染色至8 μm深度。结合fMOST技术，通过原位逐层切削和AIEgens探针实时染色的循环过程，实现了Tg小鼠全脑Aβ斑块的自动三维成像。这种方便、高效的策略无需组织渗透、荧光预标记和繁琐的洗涤过程，显著提高了标记效率。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.136840
2022年7月3日，苏州大学苏州医学院王琳辉、徐广银团队在期刊发表了题为Journal of Cerebral Blood Flow & MetabolismHigh-resolution 3D demonstration of regional heterogeneity in the glymphatic system的文章。研究人员巧妙地将荧光右旋糖酐（Dex-3）注入到小鼠小脑延髓池中以标记脑脊液(CSF)，接着对同一只小鼠进行Dylight594-lectin尾静脉注射以标记全脑血管。之后分别在30分钟后和120分钟后取脑并固定，分别利用fMOST展现CSF内流入脑和间质液(ISF)从脑中清除的途径和特征。该研究首次获得了高分辨率的全脑胶质淋巴结构，三维展示了全脑CSF流入和流出通路，揭示了胶质淋巴系统的脑区异质性，为进一步研究胶质淋巴功能提供了解剖学基础。
原文链接：https://doi.org/10.1177/0271678X221109997
2022年9月，空军军医大学与西安交通大学研究团队在期刊发表题为Neurobiology of StressBrain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model的研究论文。慢性睡眠剥夺(SD)可导致包括抑郁、焦虑、中风、永久性认知缺陷、压力等疾病。Fos基因作为一种脑活动功能标记在神经科学领域中被广泛应用，然而以往研究大多只是用传统方法或短期SD模型分析大脑某些区域c-Fos。在本研究中，作者通过fMOST和高血脑屏障通透性AAV-PHP.eB病毒对睡眠剥夺模型小鼠进行全脑c-Fos+细胞定位。结果表明，睡眠剥夺14天后，小鼠表现出焦虑样和抑郁样行为，多个脑区发生c-Fos的激活表达，为慢性SD进一步研究和治疗提供了线索。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ynstr.2022.100478
2022年3月24日，MOST团队在期刊发表了题为Communications BiologyMultiscale reconstruction of various vessels in the intact murine liver lobe的研究论文，团队利用HD-fMOST系统和PI实时复染技术建立了一套同时获取和可视化小鼠完整肝叶内的多尺度多类型脉管的方法。通过形态差异，将肝静脉、肝动脉、肝内胆管、肝内淋巴管进行了信息分割和可视化，并重建了局部肝窦和胆管周围血管丛。为肝病中脉管结构细微病理变化研究提供了技术路线，也为单细胞水平研究肝脏等富含脉管结构的器官提供了新思路和高效技术手段。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-022-03221-2
2022年7月20日，MOST团队在Cell Press细胞出版社旗下交叉学科期刊上发表了题为iScienceCryo-fluorescence micro-optical sectioning tomography for volumetric imaging of various whole organs with subcellular resolution的研究论文。该团队发展了一种低温荧光显微光学切片断层成像（cryo-fMOST）技术，以亚微米体素分辨率分别对正常小鼠的舌头、肾脏和脑以及心梗疾病模型鼠的心脏等完整器官进行了三维成像与重建，高保真地获取了精细解剖结构。并进一步对收集到的已成像冰冻脑片做了磷酸糖测定和荧光原位成像，初步展示了cryo-fMOST与多组学测量的兼容性，表明该技术有望用于空间多组学的研究。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.104805
2022年8月4日，MOST团队在期刊发表了题为Frontiers in Cardiovascular MedicineThree-dimensional visualization of heart-wide myocardial architecture and vascular network simultaneously at single-cell resolution的研究论文。借鉴所在团队自主建立的fMOST思路，发展了一种测绘完整心脏介观精细结构的新技术，解决了心脏组织结构的荧光标记、高分辨全自动成像及数据处理中的技术难题，以0.32 μm×0.32 μm×1 μm的体素分辨率实现了小鼠全心脏三维连续数据的精准获取和重建。该技术方案基于Tek-cre*Ai47转基因小鼠对血管结构进行荧光标记，并在成像过程实时染色心肌细胞；利用HD-dfMOST，采用线照明调制光学层析成像与超薄切削树脂包埋组织相结合的策略，通过成像-切削的循环实现了小鼠全心脏的三维高分辨率连续数据的获取。
原文链接：https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.945198
2022年8月26日，MOST团队在期刊发表论文biologyMultiscale Analysis of Cellular Composition and Morphology in Intact Cerebral Organoids
该研究利用人类皮肤来源的诱导多能干细胞（iPSC）培养获得大脑类器官，并使用慢病毒pLenti-hSyn-EGFP-P2A-MCS-WPRE,pLenti-shortGFAP-mCherry-WPRE(或pLenti-GfaABC1D-EGFP-WPRE)分别标记神经元和GFAP+细胞，结合fMOST技术，获得亚微米级完整大脑类器官种神经元和GFAP+细胞的空间分布，并对单细胞形态进行分析。同时，研究者利用整体3D免疫荧光分析了分化皮层神经元marker SATB+和TBR1+的空间分布情况，结果显示超过95%的标记细胞分布在类器官外层。这一套新方法能够获取亚微米级类器官的高分辨率空间信息，用于分析其细胞组成和形态，将成为揭示大脑或其他类器官细胞组成、结构、发育和病理变化的有力工具。
原文链接：https://doi.org/10.3390/biology11091270
2022年3月22日，重庆大学医学院神经智能研究中心汪萌/廖祥团队与MOST团队等机构合作，在国际期刊发表论文Nature CommunicationsBrain-wide projection reconstruction of single functionally defined neurons，该研究建立了一种称为2-SPARSE的新技术，综合了双光子钙成像、单细胞电转、病毒标记和fMOST全脑成像等方法，可实现对特定功能的单个神经元全脑范围内的形态投射进行重建。2-SPARSE避免了以往病毒标记策略的随机性和不确定性，尤其适用于解析缺少分子marker或者数目稀少但在特定脑区又广泛分布的功能性神经元。2-SPARSE有望推进当前脑科学由单神经元投射组学向单神经元功能投射组学的发展。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29229-0
2022年10月13日，MOST团队在期刊在线发表论文Advanced ScienceMapping the function of whole-brain projection at the single neuron level，研究采用rAAV体系的二元表达系统，用遗传型钙探针GCaMP6稀疏标记神经元，通过活体钙成像方法，记录清醒小鼠神经元的视觉功能响应；利用HD-fMOST获取GCaMP6标记神经元的全脑解剖形态和位置信息；通过项目组开发的方法实现跨模态细胞匹配，整合活体钙成像与高分辨率的全脑结构成像的信息，得到单神经元水平全脑投射的功能注释（functional annotation of whole-brain projection at the single neuron level, FAWPS)，由此建立了获取同一神经元的功能响应特征和轴突全脑投射信息的方法。该研究建立了能对特定类型神经元进行单细胞分辨的神经活动成像，并绘制出同一个神经元在全脑范围精细轴突投射的方法。该方法结合遗传型功能探针稀疏标记、活体双光子荧光成像、高清fMOST全脑精细结构成像和跨模态细胞匹配等多项技术，能获取同一神经元的神经活动与全脑投射信息，并在单神经元水平探索了功能偏好与轴突投射特性的关系。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202202553
关于MOST
显微光学切片断层成像(MOST)和荧光显微光学切片断层成像(fMOST)系列设备能对生物大样本进行亚微米水平三维成像，不仅可以获得单细胞分辨的全脑神经连接图谱、定位神经环路、追踪单神经元长程投射、构筑血管网络三维拓扑结构；还可用于细胞空间定量分析、单细胞形态学分析，全器官蛋白质及基因表达空间定位。MOST技术适用于多种模式生物的全器官或组织三维结构可视化，在基础科学研究、病理机制研究、药物筛选与评估、生物3D打印、三维解剖学数据库构建等领域发挥极大作用。
关于沃亿
沃亿生物基于显微光学切片断层成像(MOST)技术的系列仪器设备，在国际上率先建立了可对厘米大小样本进行亚微米水平精细结构三维成像，填补了核磁共振成像和电子显微镜之间的空白。该技术获得2011年度中国科学十大进展，2014年获得国家技术发明二等奖，2019年参加中华人民共和国成立70周年大型成就展。
