今天跟大家分享一篇2021年11月份发表在 Science 上的文章，该文的通讯作者是索邦大学的Sabine Lévi和艾克斯-马赛大学的Christophe Bernard。Sabine Lévi的研究重点是氯离子转运的神经元机制、GABAA受体的突触锚定和Kv2.1通道对神经元兴奋性的调节。Christophe Bernard的研究重点是癫痫发生和传播机制、有机电子技术记录和控制神经元活动和虚拟老鼠大脑。
在发育过程中，大脑回路会经历突触形成、稳定或消除的阶段。γ-氨基丁酸（GABA）介导的突触（GABA能突触）的形成主要取决于细胞粘附分子，如神经连接蛋白（neuroligin）和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白，它们与突触前的轴突蛋白（neurexin）和与突触前的蛋白酪氨酸磷酸酶结合的Slit-和Trk样家族蛋白相互作用。GABA和GABA A型（GABAA）受体以活动依赖的方式参与突触的成熟和修剪。三磷酸腺苷（ATP）和腺苷可以在突触处与GABA共同释放，并被腺苷A2A受体所感知。A2A受体控制迁移速度、轴突伸长和树突分支。A2A受体是否控制大脑中突触的形成、稳定或消除尚不清楚。在成年大脑中，A2A受体大多表达在突触前末梢，在那里它们控制突触囊泡释放的概率。在早期大脑发育过程中，神经突触的A2A受体的数量、位置和功能一直不清楚。
作者发现，在发育中的小鼠海马体的突触发生过程中，在P5-P16（出生后第5天到第16天）之间，A2AR的密度在突触后致密区周围短暂地增加，且腺苷的活动依赖性释放也增加。去除腺苷导致突触不稳定。在缺乏神经递质的情况下，激活A2AR或者GABAAR都能够阻止GABA能突触消除，维持稳定。但A2AR和GABAAR在发育过程中对突触稳定性的作用还未明确。因此作者利用电生理学和免疫组织化学的方法，探究了腺苷和GABA信号在GABA能突触稳定和消除中的作用及分子机制。
图 1 腺苷和GABA信号稳定GABA能突触。
首先，作者分别设计了两类短发卡RNA用于敲除GABAAR γ2亚型（shγ2）和A2ARs（shA2AR），发现突触丢失（Fig 2A, B）。然后作者分别激活A2ARs（激动剂CGS21680）和GABAARs（激动剂muscimol），发现使用CGS21680激活A2ARs后修复了敲除GABAAR γ2亚型的神经元的突触丢失；而使用muscimol激活GABAARs没有修复敲除A2ARs的神经元的突触丢失（Fig 2A, B）。该实验结果说明似乎A2ARs的激活对GABA能突触的稳定是必要且充分的，而只要A2ARs保持激活，GABAARs的激活就不是必要的。在使用SCH58261抑制A2ARs 30 min时，含有泡状GABA转运蛋白（VGAT）的突触末梢减少47 %（Fig 2C），并且微型抑制性突触后电流（mIPSCs）的频率与振幅均有所降低（Fig 2D）。进一步地，作者探究了使用SCH58261抑制A2ARs不同时间后GABA能突触的丢失情况，发现只要A2ARs失活超过20 min，GABA能突触丢失且不可逆。
图 2 （A）敲除GABAARγ2和使用CGS激活A2AR后VGAT的染色情况及数量。（B）敲除A2AR和使用mus激活GABAAR后VGAT的染色情况及数量。（C）使用SCH抑制A2AR后VGAT的染色情况及数量。（D）使用SCH抑制A2AR后微型抑制性突触后电流的频率与振幅。
接下来，作者分别使用腺苷脱氨酶（ADA）和腺苷5'(α,β-亚甲基)二磷酸钠盐（AMPCP，一种CD73的抑制剂）来去除神经元内的腺苷和抑制腺苷产生，发现降低腺苷浓度后mIPSCs的频率与振幅均有所下降，并且含有GABAARγ2的突触丢失（Fig 3A, B）。同时，作者使用CGS刺激添加了ADA或（和）AMPCP的神经元，发现突触未丢失（Fig 3B）。以上实验结果说明，清除胞外腺苷会导致GABA能突触丢失，该现象可被激活的A2AR阻止。
图 3 （A）使用ADA或（和）AMPCP降低腺苷浓度导致mIPSCs的频率与振幅降低。（B）使用ADA或（和）AMPCP及CGS后神经突触的染色情况与数量。
因为A2AR属于G蛋白偶联受体，其信号转导作用是通过激活腺苷环化酶（ACs）来产生环磷酸腺苷（cAMP）。因此，作者分别使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，抑制磷酸二酯酶代谢cAMP）和佛可司林（ACs激活剂）来刺激神经元，发现使用这两种药物可以缓解由SCH带来的突触丢失情况。这说明A2AR确实是通过ACs-cAMP通路来控制GABA能突触的突触发生。
A2AR和GABAAR分别和AC-cAMP和Ca2+信号有关，在神经发育过程中GABAAR的激活会导致胞内Ca2+浓度升高，而海马区神经元上存在Ca2+-钙调蛋白（CaM）激活的ACs，因此作者假设GABA信号通过CaM-AC通路与腺苷信号共同发挥作用。作者发现钙螯合剂（BAPTA）能够导致突触丢失，而该现象可被激活的A2AR阻止（Fig 4A）。这说明在缺乏Ca2+的情况下，A2AR的激活足以维持突触的完整性。
接下来，作者探究了Ca2+和CaM在维持GABA能突触稳定中的作用。使用CALP3激活CaM阻止了缺乏GABAARγ2的突触丢失，而在加入SQ22536（ACs的抑制剂）后突触再次丢失（Fig 4B）。以上实验结果说明CaM是通过ACs的激活来维持突触稳定的。海马区神经元在脂筏上表达Ca2+依赖性的ACs，在非脂质质膜上表达Ca2+非依赖性的ACs，因此作者分别构建了两类靶向于脂筏（Kras-cAMP）与非脂质质膜（lyn-cAMP）的海绵用于干扰局部的cAMP浓度，发现脂筏上cAMP浓度降低阻止了CALP3介导的突触修复（Fig 4C）。实验结果说明A2AR和GABAAR通过Ca2+依赖性、CaM激活的ACs产生cAMP来共同发挥作用维持GABA能突触稳定。
图 4 （A）使用BAPTA、ADA和AMPCP、CGS后神经突触的染色情况与数量。（B）使用CALP3和SQ22536后缺乏GABAARγ2神经突触的染色情况与数量。（C）使用海绵干扰局部cAMP浓度后缺乏GABAARγ2神经突触的染色情况与数量。
蛋白激酶A（PKA）是A2AR激活后cAMP的下游效应子，它能够介导桥蛋白结构中第303位上的丝氨酸发生磷酸化，这是维持突触稳定所必需的。首先，作者在去除神经元内的腺苷后使用CGS激活A2AR，观察桥蛋白上303位丝氨酸的磷酸化程度，发现在去除腺苷的情况下，使用CGS激活A2AR能够明显增加桥蛋白的磷酸化程度，而303位突变的桥蛋白磷酸化程度未发生变化（Fig 5A），说明A2AR激活能够导致桥蛋白的磷酸化。随后，作者分别将303位上的丝氨酸替换为天冬氨酸和丙氨酸，发现与对照组相比，在去除腺苷后，桥蛋白的突变阻止了突触丢失（Fig 5B），这说明桥蛋白发生磷酸化是A2AR介导的突触稳定所必需的。同时，作者还发现桥蛋白上过表达的天冬氨酸突变体足以挽救缺乏GABAARγ2的突触丢失（Fig 5C），这说明桥蛋白对于维持突触稳定有着重要的作用。
图 5 （A）野生型与突变型桥蛋白的磷酸化程度。（B）在去除腺苷后，桥蛋白野生型与突变型的神经突触的染色情况与数量。（C）在缺乏GABAARγ2的神经突触中，桥蛋白突变后突触的染色情况与数量。
接下来，作者假设303位磷酸化的桥蛋白能够与突触后神经连接蛋白2或Slitrk3跨膜蛋白相互作用，这些跨膜蛋白在突触间隙与突触前神经胶质蛋白或PTPδ结合，以组织抑制性突触。因此，作者敲除了神经突触中的Slitrk3，并发现激活A2AR或GABAAR并不能阻止突触丢失（Fig 6A）。除此之外，作者还将Slitrk3结构中969位上的酪氨酸突变为丙氨酸，发现A2AR的激活并不能阻止突触丢失（Fig 6B）。实验结果说明，敲除Slitrk3或是Slitrk3发生单个氨基酸突变足以破坏GABA能突触的稳定性。最后，作者使用免疫共沉淀的方法，发现桥蛋白能够与Slitrk3发生相互作用（Fig 6C）。以上实验结果说明，A2AR通过PKA依赖性的的桥蛋白磷酸化与Slitrk3相互作用来维持突触的稳定。
图 6 （A）敲除Slitrk3后激活A2AR或GABAAR的神经突触的染色情况与数量。（B）突变Slitrk3后激活A2AR或GABAAR的神经突触的染色情况与数量。（C）桥蛋白与Slitrk3相互作用的免疫沉淀染色。
综上所述，腺苷介导的A2AR信号通过AC-cAMP–PKA-桥蛋白-Slitrk3通路来控制GABA能突触的稳定，GABA会促进这一过程。如果A2AR保持无活性>20分钟，突触不稳定是不可逆的。在突触发生过程中拮抗A2AR，会导致动物在发育过程中丧失GABA能突触，并在成年时出现认知障碍。
作者：丁琪
