光遗传学（optogenetics）——结合遗传工程与光来操作个别神经细胞的活性，它利用光敏离子通道蛋白对特定神经细胞进行精准、快速的时空控制，在神经类疾病的治疗中也展现出巨大的潜力。Brainnews 精选了2021年光遗传学研究的最新进展及报道 10 篇，一起来学习！
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北京时间2021年5月10日晚23时，Nature Neuroscience在线发表了美国西北大学关于可植入型无线光遗传电子器件的研发成果，阐明了其广泛应用于光遗传动物个体和群体行为学实验的前景。
美国西北大学材料工程系及生物医学系John A. Rogers教授、神经生物系Yevgenia Kozorovitskiy教授、机械工程系及土木环境工程系黄永刚教授和大连理工大学工程力学系解兆谦教授为该论文共同通讯作者。博士生杨翌元、武名政、博士后Abraham Vázquez-Guardado为该论文共同第一作者。
该论文作者采用电感耦合方式给可植入器件提供持续性电源，并结合近场通讯和微型处理器技术来提供光刺激参数（包括强度，频率，工作周期和工作模式）的实时控制。于此同时，作者采用力学优化的可延展柔性电子技术极大程度的降低了植入对动物的创伤并保证器件植入后的长期稳定工作。
另外，该论文提出两种器件设计分别为头部植入器件和背部植入器件，前者更加方便于手术植入，后者将电子元件与探针分离来获取更大的植入空间并实现更高效的电能采集以及电子功能的升级。
（上）
（中）
（下）
动物光遗传行为学实验示意图。实验采用环绕笼子的传输线圈和器件中的接收线圈之间的电感耦合提供电源（上）。器件分别采用头部植入设计（中）和背部植入设计（下）。
该论文成功在群体层面操控小鼠个体间的同步化和去同步化神经活动，证明了内侧前额叶皮质(mPFC)的脑间同步化神经活动并引起社交偏好。这项工作解决了之前无线光遗传领域在实时个体化控制功能方面的欠缺，展示了新一代无线光遗传器件在行为神经科学中广泛的应用前景。
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2021年5月6日，Texas A&M University的周育斌教授课题组，中科院合肥物质科学研究院的王俊峰研究员课题组，University of Massachusetts Medical School的韩纲教授课题组以及Texas A&M University的黄韵教授课题组合作（文章的共同第一作者为何涟博士，朱磊博士，谭鹏博士以及黄凯）在Nature Chemical Biology上发表了题为Circularly permuted LOV2 as a modular photoswitch for optogenetic engineering 的文章。
该研究对LOV2进行了优化循环排列（circular permutation）设计，获得了能将效应子融合到蛋白N端，并提供不同锁定界面的新型光遗传学工具cpLOV2。cpLOV2不仅能够为原已在LOV2体系中实现的技术提供了新的构建方式，例如钙离子通道的远程开启，CRISPR–Cas9介导的基因编辑控制，基因转录的光控重编程等，还创新性地开发了LOV2体系无法实现的光遗传学应用，例如基于MLKL的癌细胞自杀的激活等。特别是基于cpLOV2实现的，可以精准地调控对肿瘤细胞体内杀伤的光控嵌合抗原受体T细胞（optoCAR T）免疫疗法，获得了显著效果。
图：cpLOV2改造设计及其光遗传学应用拓展阅读链接：
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目前已有的光遗传学工具应用于突触前末端时存在低效率（eNpHR3.0）以及脱靶效应（eArch3.0），而化学遗传手段虽然能够通过结合GPCR来调控突触前末端神经递质的释放，但时空精确性不足。
那么是否能够有一种不易受光漂白的Gi/o偶联视紫红质，能够实现高效且靶向光调控突触前神经递质的释放呢？
近日，来自于以色列魏兹曼科学研究所神经生物学系的Ofer Yizhar研究员及其博士后学生Mathias Mahn基于上述思考，筛选开发了新的光遗传学工具，即是脊椎动物脑视蛋白的靶向增强型蚊源同源蛋白（eOPN3），这一蛋白能够通过Gi/o信号通路来减少突触前末端神经递质的释放进而有效抑制突触传递。
图1 eOPN3的构建 这项研究与Bruchas 和Gereau实验室使用七鳃鳗parapinopsin（PPO）是首次描述了双稳态非视觉性视紫红质的光遗传学应用，可有效经光控门控沉默突触传递。
eOPN3和PPO的独特光谱特征，特别是在它们的两个光子截面中，将有可能使它们共同用于细胞内信号转导的双通道光遗传学控制。这两种视紫红质是广泛的非视觉视紫红质家族的一员，该家族的其他成员在异源表达时表现出结合Gi/o信号通路的性质。
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近年来，科学家们通过将光敏蛋白ChR2与多种亚细胞定位标签相融合使光遗传学技术得到了进一步发展。虽然定位标签修饰的ChR2变体极大促进了靶神经元的局部及有效激活，然而到目前为止，能选择性沿着神经元远程轴突传递以实现精确的突触前激活的ChR2变体仍未被开发。
因此，有必要开发轴突导向的新型ChR2工具，使光遗传学工具在体内外更优先刺激轴突投射并控制突触传递，为神经环路的研究提供更多可能性。
近日，日本山梨大学研究人员在Communications Biology上论述了新型光遗传学工具ChR2-mGluR2-PA可特异性靶向神经元轴突末端，诱导长距离轴突末梢的突触传递，并在尖峰碰撞试验中降低多突触噪声有效识别轴突投射。文章题为“An engineered channelrhodopsin optimized for axon terminal activation and circuit mapping”。
研究人员发现向ChR2添加定位信号mGluR2-PA标签(代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）C端与蛋白水解基序和轴突靶向信号融合而成)，能将ChR2-YFP优先定位于轴突末端而不干扰其正常的功能，并且能以较低的光刺激水平诱发突触反应。
在尖峰碰撞试验中，mGluR2-PA标记的ChR2能有效识别轴突投射，显著减少多突触过量噪声。本研究证实mGluR2-PA标签有助于促进ChR2向神经元轴突末端的运输，为光遗传学技术在神经回路研究中的应用提供了更多的可能性。
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光遗传干扰，是将光敏离子通道和泵嵌入遗传靶向神经元细胞膜中，通过光调节其活性，在精确的时间内，激活和抑制某些特异性细胞以控制神经活动，这彻底改变了神经科学研究模式。
该方法已经广泛应用于啮齿类动物大脑，但少有研究表明光遗传学干扰对非人灵长类动物(NHPs)的行为影响。2021 年 8 月 30 日，麻省理工学院脑与认知科学系Rishi Rajalingham等发表了题为“Chronically implantable LED arrays for behavioral optogenetics in primates”的文章。
他们开发了一种可长期植入的发光二极管阵列，用于高通量光遗传学干扰，研究复杂大脑（如恒河猴）的行为光遗传学。
该研究验证了光阵列可以光遗传沉默猕猴初级视觉皮层，导致在亮度辨别任务中存在明显的视觉缺陷，并排除了组织加热效应的干扰，表明光阵列在大型脑的行为光遗传学应用中的有效性。
为在NHPs进行光遗传学实验，利用了光遗传学的优势——精确的空间和时间控制指定基因型的神经元，研究者开发了Opto-Array，一种长期可植入的LED阵列。
Fig. 1 | opto-Array designa光电阵列设计原理图。b通过输入电压控制单个LED光输出功率作为输入强度的函数，水平虚线对应猴子身上可测量的行为效应的光学电极平均输出功率。c与发光二极管表面横向距离小于1 mm的水平面上，光功率的空间密度。d根据输入能量激活不同组的LED产生的最高升温。机载热敏电阻测量的升温显示在左侧y轴上，而估计的大脑表面升温显示在右侧y轴。e在占空比为50%的情况下，通过改变LED激活时间的频率，相应的热传感器响应的增加。f Opto-Array手术植入物示意图。
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复旦大学脑科学研究院、医学神经生物学国家重点实验室、脑科学前沿中心张嘉漪研究员团队与复旦大学化学系张凡教授团队开展合作，基于近红外光对生物组织穿透能力强和抗光漂白的特性，研发了一种三色上转换（upconversion）纳米材料，该材料具备将808 nm、980 nm和1532 nm三种不同波长的近红外光转变为540 nm（绿）、450 nm（蓝）和650nm（红）三种可见光的特性，与传统单色上转换材料相比，三色上转换材料的光谱线宽更小，有利于实现更精准的调控。
团队在PV-Cre:SOM-flp转基因小鼠皮层的PV、SOM和CaMKII三种不同类型神经元中分别表达由红、绿、蓝光激活的三种光遗传蛋白，并将该纳米材料注射到小鼠皮层，在小鼠颅骨完整的情况下，用三种近红外光分别激活三种神经元，在虚拟现实系统中，成功地经颅选择性调控活体小鼠的运动速度。
2021年9月27日，相关研究成果以《通过三色上转换对多个神经元集群进行近红外调控》（“Near-infrared manipulation of multiple neuronal populations via trichromatic upconversion”）为题，在线发表于《自然· 通讯》（Nature Communications）( Nat. Comm., 2021, DOI: 10.1038/s41467-021-25993-7)。该技术实现了非侵入式无线光遗传调控，有望被用于解析包含多种类型神经元的神经环路功能，并具有临床应用的潜力。
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2021年10月4日，华东师范大学生命学院、上海市调控生物学重点实验室、医学合成生物学研究中心研究员叶海峰团队在Nature Biotechnology杂志上以研究长文（Research Article）发表题目为 A small and highly sensitive red/far-red light-mediated optogenetic switch for multiple applications in mammals 的研究论文，历时五年，开发了一种模块小且灵敏度高的新型光遗传学工具——REDMAP系统，其设计原理图如下：
图1. REDMAP系统的设计和优化PhyA（phytochrome A）是来自植物拟南芥中的一种光敏蛋白，其在色素小分子PCB（chromophore phycocyanobilin）的帮助下可受波长为660nm的红光和730nm的远红光调控，进而可逆的和其伴侣蛋白FHY1（far-red elongated hypocotyl 1）结合（660nm）或分离 (730nm)。根据这一特点，研究人员将PhyA和GAL4的DNA结合域进行融合表达形成了一个可受红光调控的杂交DNA结合蛋白（PhyA-Gal4），同时还将FHY1和反式作用元件VP64进行融合表达形成了一个光依赖的转录激活因子（FHY1-VP64）。红光照射下，PhyA-GAL4和FHY1-VP64二聚并入核，通过识别并特异性结合到启动子上，从而启动下游报告基因SEAP（Secreted human placental alkaline phosphatase）的表达。
受红/远红光调控，与现有的光遗传学工具相比，REDMAP系统具有高转录激活效率 (1s, >150倍) 和快速激活/失活 (1s) 动力学的特点，同时该系统具有更高的灵敏度和更高的基因诱导倍数。研究者认为， 该REDMAP系统为目前报道的最先进的非离子通道类光遗传基因开关，并成功地将REDMAP用于转基因表达、调控细胞内信号通路、控制表观基因组重塑。
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光遗传探针，如盐视紫红素和原始视紫红素，可通过超极化膜电位间接抑制递质释放抑制大脑活动，但会引起反常的离子不平衡和反弹峰值，并不适用于非兴奋性胶质细胞。
近期，发表在Neuron上题为“Opto-vTrap, an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release, synaptic transmission, and behavior”的文章。设计光诱导和可逆抑制系统Opto-vTrap，发现在光伏脑片激活后，急性脑切片的突触和胶质传输显著减少。并提出Opto-vTrap可以最小的干扰效应控制大脑活动和行为。
新开发的Opto-vTrap可用于光诱导的囊泡释放、突触传递、胶质传递和行为的可逆抑制，并在如今成为抑制光基因探针的首选。此外，Opto-vTrap的优点是它的快速恢复时间和它的设计基于LARIAT，利用CIBN和CRY2相互作用进行照明。所以，基于LARAT的Opto-vTrap有望在未来开发出新的通用和灵活的光遗传工具。
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光遗传蛋白的稀疏表达和单光子照射可以激活定义的神经元集合，但其空间分辨率较低，无法全面地理解高精度的神经活动或进行神经计算，而多光子全息光遗传学有望解决这一挑战。
通过提供特定功能的神经元集合在空间和时间中重现某种神经活动模式的能力，为神经科学家揭示了编码感觉、认知和行为相关的神经代码基本机制。
近日，加州大学伯克利分校海伦威尔斯神经科学研究所Hillel Adesnik与Lamiae Abdeladim在Nature Neuroscience 联合发表了题为“Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics”的综述。
该文总结了多光子全息光遗传学的最新进展及其可扩展的应用范围，突出了重要的技术挑战，并概述了它可以执行的测试和验证大脑功能的关键理论模型。
多光子全息光遗传学可能成为治疗性光学-脑界面的基础。利用全息光遗传学的精确性扰动，更有效地产生神经动力学，为那些视觉或听觉障碍的人创建有效的皮层感觉假体达到人工感知，此外，较高皮层区域的全息假体可以通过闭环空间精确的干预来治疗认知障碍。
Fig. 1 two-photon holographic optogenetics
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2022年1月3日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋教授团队在Nature Biotechnology杂志上在线发表了题为Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins 的研究长文。该研究基于合成生物学及光遗传学原理并结合全新的高通量筛选策略成功构建了系列光控RNA效应因子，实现了动物细胞内RNA生成、剪接、运输、翻译、降解等代谢活动的时空精密控制。
图：RNA光遗传学控制概念图为了实现RNA结合蛋白的光遗传学控制，研究团队首先基于合成生物学理性设计并结合全新的高通量筛选策略，构建了国际上首个人工合成的光控RNA结合蛋白LicV。LicV由RNA结合结构域与LOV光敏结构域融合构成，分子量仅为23 kD。在黑暗条件，LicV是以单体形式存在，不能结合特定的RNA序列（RAT）；在蓝光照射下，LicV形成同源二聚体并特异性识别结合RAT序列。研究团队随后将LicV与不同的RNA效应结构域融合，分别获得光控RNA剪接因子、光控RNA定位因子、光控RNA翻译因子以及光控RNA降解因子。他们利用这些光控RNA效应因子实现了活细胞RNA剪接、运输、翻译、降解等代谢行为的时间和空间精密控制。
