导读：
线粒体是维持细胞内环境稳定的重要细胞器，线粒体自噬介导的对缺陷线粒体的清除受损是阿尔茨海默病(AD)发病机制中的关键事件。近期，《Molecular Neurodegeneration》期刊发表了题为“Cholesterol alters mitophagy by impairing optineurin recruitment and lysosomal clearance in Alzheimer’s disease”的论文，作者团队揭示了一种新的机制，将胆固醇诱导的线粒体氧化应激与线粒体清除减少和AD进展联系起来。胆固醇对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬具有双重作用，一方面损害溶酶体对线粒体自噬体的清除，另一方面促进氧化诱导的OPTN聚集体的积累，从而阻止PINK1/Parkin激活的线粒体募集。
1. 胆固醇促进Aβ诱导的线粒体吞噬小体形成，同时损害溶酶体对线粒体的清除
为了研究细胞内胆固醇对线粒体自噬的影响，作者团队首先用水溶性胆固醇复合物(CHO：MCD)处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，并将其暴露于10μM寡聚体Aβ中24 h。处理后通过对细胞进行菲律宾菌素(0.25 mg/ml)染色证实了胆固醇含量的增加，菲律宾菌素是一种能特异性结合胆固醇的荧光多烯抗生素。荧光显微镜图像显示CHO：MCD处理的细胞内染色较高且均匀(图1a)。自噬诱导后，自噬小体形成的一个关键条件是胞液LC3B在吞噬体膜上的募集以及随后与磷脂酰乙醇胺的结合。因此，脂化LC3B(也称为LC3B-II)水平已被广泛用作自噬体内含量的衡量标准。如图所示(图1b)，当溶酶体亲和剂氯喹(CQ)阻断自噬通量时，Aβ可诱导富含胆固醇细胞的自噬小体合成，使LC3B-II：LC3B-I比值显著增加。为了分析细胞中的线粒体自噬，我们接下来用抗LC3B和细胞色素C(CYC)的抗体进行双重免疫染色，作为线粒体的标志(图1c)。正如预期的那样，共聚焦显微镜显示在Aβ孵育后有更多的自噬小体(LC3B点状)存在。在富含胆固醇的细胞中，LC3B阳性囊泡和线粒体标志物之间的共存程度更高(图1C)。然而，尽管自噬小体的形成增强，但当细胞胆固醇含量较高时，溶酶体标记LAMP2(溶酶体相关膜蛋白2)和CYC之间没有明显的共定位(图1d)。因此，作者认为富含胆固醇的细胞中有线粒体自噬小体积累的部分原因是自噬分解有缺陷。
为了评估活细胞中的线粒体自噬通量，作者使用了针对线粒体基质的单体keima探针和线粒体靶向信号肽序列(mt-mkeima)。在线粒体的生理pH下，mt-mKeima在440 nm处的激发占主导地位，然而，当线粒体被输送到酸性溶酶体环境中时，mt-mKeima的激发光谱的峰值从440 nm移动到586 nm。利用这些特性，稳定表达mt-mKeima的慢病毒转导SH-SY5Y细胞胆固醇富集，并在Aβ暴露后用共聚焦显微镜分析自噬溶酶体的形成(图1e)。在暴露于细胞毒肽48h的对照细胞中，mt-mKeima的双激发比成像显示在561 nm的激发波长处有强信号的细胞质斑点结构(图1e)。有趣的是，与免疫细胞化学的结果一致，当暴露于Aβ的细胞预先被胆固醇富集时，在561nm处没有观察到荧光信号，这表明线粒体向溶酶体的输送受到干扰(图1e)。因此，如前所述，根据这些比率图像计算的线粒体自噬指数，在暴露于Aβ的对照细胞中随着时间的推移而累积增加，而在CHO：MCD处理的细胞中保持不变(图1f)。因此，细胞内胆固醇水平的上升损害了线粒体自噬通量，而不考虑线粒体的损伤。
图1 SH-SY5Y细胞中胆固醇的富集增强了Aβ诱导的线粒体自噬小体的形成，同时损害了溶酶体对线粒体的清除2. 胆固醇介导的线粒体谷胱甘肽耗竭促进暴露于Aβ的胚胎皮层/海马神经元PINK1介导的不完全线粒体自噬
由于神经元对线粒体功能的能量依赖性很高，而且神经元不能通过细胞分裂来稀释线粒体损伤，所以在原代神经元培养中观察到的富含胆固醇的SH-SHY5Y细胞的线粒体自噬改变可能是不同的。为了评估这一可能性，将野生型(WT)和SREBF2小鼠的胚胎皮层/海马神经元与5μM的 Aβ孵育24小时，并用抗LC3B和抗CYC抗体进行双重免疫染色(图2a)。共聚焦图像显示，在Aβ处理后，细胞胞体中有明显的LC3B阳性结构积累，这些结构与线粒体标记部分共存(图2A)。与WT细胞相比，SREBF2细胞中线粒体与LC3B斑点的共定位程度显著高于WT细胞(图2a)。同时，通过抗LAMP2和抗CYC抗体的共同免疫染色来评估线粒体自噬溶解的能力。共聚焦显微镜显示，在Aβ(图2B)诱导的WT细胞中，双重染色的CYC和LAMP2阳性结构数量增加。相反，在SREBF2细胞中没有发现线粒体和溶酶体标记之间明显的共定位(图2b)，因此，表明了在胆固醇富集的SH-SY5Y细胞中观察到的线粒体自噬通量缺陷。同样值得注意的是，在WT细胞中，溶酶体主要分布在神经元胞体中，并与线粒体标记共存，而在SERBF2细胞中，在Aβ或雷帕霉素刺激后，溶酶体仍均匀分布在核周和轴突上(图2b)。此外，与WT细胞不同的是，SERBF2细胞中的线粒体在诱导线粒体后大多积累在胞体中，在轴突中显示出更多的碎片化模式(图2b)。
此外，在富含胆固醇的神经元培养中，由Aβ诱导的LC3B阳性囊泡的在用谷胱甘肽乙酯处理后被消除。谷胱甘肽乙酯是一种细胞渗透型的谷胱甘肽，可恢复线粒体谷胱甘肽池并防止Aβ引起的氧化损伤。与这些数据一致的是，GSHee预处理显著抑制了SREBF2细胞的线粒体自噬(图2c)。线粒体还原型谷胱甘肽恢复后，Aβ处理的SREBF2细胞共聚焦显微镜显示CYC和LC3B阳性小泡明显减少。GSHee处理还减少了PINK1在这些细胞中的线粒体积累，共聚焦显微镜显示关键的线粒体自噬蛋白和线粒体标记之间无共定位（图2c）。此外，共聚焦显微镜分析表明，PINK1的线粒体稳定和随后的Aβ诱导的SREBF2细胞在没有Parkin募集的情况下发生了线粒体自噬(图2d)。细胞内的E3泛素蛋白连接酶仅在钾离子载体缬氨霉素处理后出现移位，这些发现表明，Aβ在培养的原代神经元上触发了PINK1介导的parkin非依赖性线粒体自噬，这种作用因胆固醇诱导的线粒体谷胱甘肽耗竭而加剧，并且线粒体膜电位没有丧失。
图2 胆固醇诱导的线粒体谷胱甘肽耗竭刺激Aβ暴露的原代培养神经元中PINK1介导的不完全线粒体自噬3. SREBF2在APP-PSEN1神经元中的过表达诱导PINK1介导的线粒体自噬体聚集，但阻止线粒体自噬完成
为了进一步探索胆固醇在AD进展过程中对线粒体自噬途径的影响，作者使用了WT和APP-PSEN1小鼠的原代神经元培养和大脑，这些小鼠在不同年龄过表达SREBF2和不过表达SREBF2。在神经元培养中，与高胆固醇负荷阻断自噬最后几步的报道一致，在APP-PSEN1-SREBF2细胞中，尽管形成了线粒体自噬体，但没有发现线粒体和溶酶体标记LAMP2之间的共存(补充图8a)。共聚焦分析还显示，APP-PSEN1-SREBF2细胞线粒体中PINK1和自噬受体SQSTM1的存在增加(补充图8b)。但是，与暴露于Aβ的SREBF2细胞一样，PINK1的线粒体积累并没有刺激Parkin的募集(补充图8c)。泛素连接酶仅在用缬氨霉素处理细胞时才发生向线粒体的移位，这会如预期的那样显著降低线粒体膜电位(补充图8d)。
补充图8 APP-PSEN1神经元中SREBF2的过度表达导致线粒体自噬体的积累，但阻止线粒体自噬完成4. 尽管存在高PINK1/Parkin线粒体，但APP-PSEN1-SREBF2脑显示线粒体自噬受阻，线粒体对线粒体自噬体合成机制的招募中断
当分析WT和突变小鼠大脑中分离的线粒体中的线粒体自噬标志物时，结果略有不同。Western blot分析显示，全长PINK1仅在过表达SREBF2的APP-PSEN1小鼠线粒体中(图3a)，而55 kDa加工形式在所有匀浆中的水平都相似，无论小鼠基因型如何(图3a)。有趣的是，与以前在细胞培养中观察到的不同，APP-PSEN1-SREBF2脑中PINK1的线粒体积累伴随着parkin的存在(图3a)。相反，在WT小鼠和其他突变小鼠中，Parkin在总的脑提取液中被检测到(图3A)。作者检测了WT和突变小鼠分离的线粒体中脂化LC3B的水平随年龄的增长(图3b)。出乎意料的是，尽管参与了PINK1-Parkin通路，APP-PSEN1-SREBF2小鼠的线粒体在分析的任何年龄都没有显示出自噬标记LC3B的招募。ULK1蛋白激酶复合物的招募，这是启动线粒体自噬的关键要求，在三重转基因小鼠的大脑中也被钝化，在线粒体部分没有检测到丝氨酸/苏氨酸激酶ULK1的存在(图3a)。与这些发现一致的是，从APP-PSEN1小鼠大脑中分离的自噬小体的免疫印迹显示，无论SREBF2是否过表达，线粒体标志物CYC的水平都是相似的(图3c)。此外，在两种基因型之间的内溶酶体组分中未观察到CYC水平的差异（图3c）。总之，这些发现表明，尽管PINK1-parkin被招募，但APP-PSEN1-SREBF2小鼠的线粒体自噬体的形成受到干扰。值得注意的是，当体内注射雷帕霉素引起线粒体自噬时，结果是不同的。与WT小鼠(图3C)相比，经雷帕霉素处理的SREBF2小鼠脑中分离的自噬体内CYC增加，并伴有内切酶体内低水平的线粒体标志物(图3c)，这与溶酶体融合能力因胆固醇升高而丧失一致。
图3 APP-PSEN1-SREBF2大脑表现出线粒体自噬障碍，核心蛋白募集中断，导致线粒体积累5. APP-PSEN1-SREBF2脑中线粒体自噬功能受损导致线粒体含量增加
为了进一步探讨胆固醇介导的线粒体自噬障碍是否影响APP-PSEN1-SREBF2脑中的线粒体含量，用dPCR定量了不同大脑区域(前额皮质、海马和小脑)的线粒体DNA(MtDNA)拷贝数(图3d)。结果，在过表达SREBF2的APP-PSEN小鼠的海马中，mtDNA随年龄的增加而增加(图3D)。在WT和其他转基因小鼠的海马中，mtDNA含量在晚龄时没有变化(APP/PSEN1小鼠)，甚至下降(WT和SREBF2小鼠)(图3d)。
为线粒体质量控制程序的一部分，mtDNA拷贝的增加也可以部分反映由受损的线粒体触发的线粒体生物发生。为了验证这种可能性，首先测定共转录调节因子PGC-1a/PPARG共激活因子1α(PPARGC1A)的表达水平，PPARGC1A是线粒体生物发生的主要调节器，它通过激活核呼吸因子1和2(NRF1和2)调控多种线粒体相关蛋白的表达，包括线粒体转录因子A(TFAM)，最终负责推动线粒体DNA的转录和复制。如图3e所示，7月龄APP-PSEN1-SREBF2小鼠的脑提取液免疫印迹显示PGC-1α水平显著高于WT小鼠(图3e)。相反，在有和没有SREBF2过表达的10个月大的APP-PSEN1小鼠的脑提取液中发现转录调节因子减少(图3e)。与这些发现一致的是，Tfam的mRNA水平只在7月龄APP-PSEN1-SREBF2小鼠的大脑中显著增加(图3f)，这与TFAM蛋白水平的增加有关(图3g)。在分析的任何年龄，WT小鼠和其他突变小鼠的TFAM表达水平没有显著变化(图3f和g)。因此，这些结果表明，尽管APP-PSEN1-SREBF2小鼠7月龄前脑内mtDNA含量的增加部分是由于生物发生诱导，但晚龄mtDNA含量的增加只能解释为线粒体自噬缺陷。
6. APP-PSEN1-SREBF2小鼠脑线粒体PINK1-Parkin信号通路在衰老过程中的渐进性激活
在确定APP-PSEN1-SREBF2小鼠的线粒体自噬通量受损并导致线粒体含量增加后，作者团队接下来试图更深入地了解这些胆固醇介导的衰老变化的本质，将分析重点主要放在PINK1-Parkin事件级联的最初步骤上。如图所示，只有来自APP-PSEN1-SREBF2小鼠的线粒体显示出显著的年龄依赖性PINK1积累，并伴有parkin募集增强（图4a）。
在健康线粒体中，PINK1靶向于线粒体内膜，并被菱形膜内蛋白酶PARL(早老素相关的菱形体)切割。最近的研究表明，线粒体生物能量应激促进了PARL的自动催化切割，产生了一个C-末端PARL(PACT)片段，在处理PINK1时效率较低。作者用Western blot分析了线粒体提取物中PARL的存在和由此产生的处理后的PACT片段(图4b)。免疫印迹显示，APP-PSEN1-SREBF2小鼠大脑线粒体的PACT/PARL比率随年龄的增长而增加，而WT小鼠的线粒体显示出类似的PACT/PARL比率，与年龄无关。因此，三重转基因小鼠线粒体中这种蛋白水解缺陷的PARL片段的增加可能有利于观察到的PINK1水平的升高，尽管还需要进一步的研究来证明其中的机制联系。
接下来，作为对PINK1功能的测量，作者用磷酸亲和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Phos-tag SDS-PAGE)检测了PINK1在线粒体提取物中的磷酸化状态，这是一种基于Phos-tag试剂结合磷酸化蛋白和延缓其电泳迁移率的能力的检测。Phos-Tag免疫印迹显示，与APP-PSEN1样本相比，7月龄APP-PSEN1-SREBF2小鼠大脑线粒体提取物中存在更多较慢的迁移条带(图4c)，正如预期的那样，这些条带在磷酸酶处理后消失(图4d)。这些移动的条带在老年APP-PSEN1-SREBF2小鼠中更加明显，表明过度磷酸化的PINK1逐渐积累(图4d)。为了进一步证明PINK1-parkin信号轴是活跃的，作者分析了多泛素化链的水平，特别是那些通过63位(K63)赖氨酸残基连接的链，这些链充当自噬受体的支架。免疫印迹显示，与WT和APP-PSEN1小鼠相比，APP-PSEN1-SREBF2小鼠脑线粒体提取物中的高分子量条带随年龄增加而积累(图4e)。对APP-PSEN1-SREBF2小鼠海马切片的免疫染色分析证实了线粒体中K63-泛素水平的增加，显示出与线粒体膜外膜20易位酶(TOMM20)的高度共定位(图4f)。值得注意的是，GSHee体内处理2周后，线粒体泛素募集完全取消(图4f)。因此，这些发现表明，APP-PSEN1-SREBF2小鼠的大脑高胆固醇水平通过调节氧化应激来刺激Pink1-parkin介导的泛素信号。
图4 APP-PSEN1-SREBF2小鼠大脑线粒体Pink1-parkin通路的年龄依赖性激活7. 老年APP-PSEN1-SREBF2小鼠OPTN线粒体易位减少，原因是侵袭体结构积聚
下一步是评估线粒体中是否存在自噬受体。根据以前的研究，SQSTM1的作用仅限于线粒体聚集，而OPTN和NDP52可能是主要的PINK1-parkin依赖的线粒体自噬受体。与WT和其他突变小鼠的样本相比，三重转基因小鼠线粒体中自噬受体的存在显著降低(补充图12b)。过表达SREBF2的APP-PSEN1小鼠脑线粒体中OPTN含量随年龄递减(图5a)。相反，Aβ处理的急性富含胆固醇的SH-SY5Y细胞显示OPTN的线粒体水平增加，随之而来的是LC3B-II的招募(补充图12c)，这与观察到的线粒体自噬体的形成一致(图1c)。因此，这些发现表明，APP-PSEN1-SREBF2小鼠大脑中的慢性胆固醇积累导致OPTN移位到线粒体的年龄依赖性损害。
作者研究了APP-PSEN1-SREBF2小鼠OPTN的线粒体水平降低是否与TBK1的有限磷酸化介导的激活相关。Western blot分析显示，老年APP-PSEN1-SREBF2小鼠大脑提取物中磷酸化TBK1的含量显著减少；然而，这种减少在WT小鼠的大脑中更加明显(图5b)，这表明三重转基因小鼠线粒体中OPTN的较低存在不能简单地用TBK1活性随年龄的变化来解释。
光显微镜还观察了OPTN在小鼠脑内的表达和分布(图5c)。与WT和APP-PSEN1脑相比，10个月大的APP-PSEN1-SREBF2小鼠海马中抗OPTN的免疫染色产生了更高的强度(图5c)。尽管如此，自噬受体并没有与线粒体标记TOMM20共定位，而是在胞浆沉积物中积累(图5c)。为了证实APP-PSEN1-SREBF2小鼠海马神经元中OPTN的胞浆积聚是侵袭体结构的一部分，作者分析了它们与组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的相互作用，组蛋白去乙酰化酶6在多泛素化蛋白的招募和随后的侵袭体形成中起着关键作用。与刺激的侵袭体合成一致，10月龄的三重转基因小鼠的海马显微照片显示，与OPTN共定位的HDAC6的存在增加(图5d)。此外，APP-PSEN1-SREBF2脑切片的Filipin染色显示，含有OPTN的侵袭体中明显存在胆固醇；相比之下，在WT和APP-PSEN1大脑样本中，细胞内胆固醇染色几乎可以忽略不计(图5e)。在所有病例中，由于样本在OPTN和HDAC6免疫染色前已被渗透，所以细胞膜未被Filipin标记。有趣的是，当小鼠接受GSHee体内处理时，含有OPTN的侵袭体的形成显著减少(图5f)，这表明持续的胆固醇介导的线粒体GSH耗竭以及随后在老年APP-PSEN1-SREBF2小鼠中的氧化应激可能在调节OPTN的表达及其招募到侵袭体中发挥关键作用。
图5 老年APP-PSEN1-SREF2小鼠中与氧化诱导的OPTN阳性侵袭体相关的OPTN对线粒体的募集减少8. AD患者海马中含OPTN侵袭体的存在与晚期线粒体胆固醇水平升高相关
最近，方等人提出了自己的观点。已经提供了令人信服的证据表明AD患者的海马区线粒体自噬功能受损。他们还报告了脑提取液中OPTN的水平没有变化；然而，OPTN在细胞内的分布并没有得到专门的评估。作者通过分析年龄匹配的AD患者和对照组的死后海马组织中含有OPTN的侵袭体的存在来解决这个问题(表1中的患者信息)。免疫组织化学分析显示，AD患者海马中的HDAC6阳性结构随AD分期递增，与对照组相比，与OPTN的共定位程度更高(图6a)。高倍镜下，对照组织的共聚焦显微镜显示OPTN免疫阳性反应均匀分布于神经元胞体(图6B)。相反，在AD组织的锥体神经元中发现了自噬受体的核周积聚，在AD VI晚期，锥体神经元向更致密的侵袭性结构发展(图6b)。为了避免报道的在人脑组织免疫组织化学中使用菲林平的缺点（光漂白问题和菲林平激发波长的高自体荧光），作者使用重组产气荚膜溶素O，一种与谷胱甘肽S-转移酶（GST-FPO）融合的胆固醇结合细菌毒素。首先进行了蛋白质-脂质重叠分析，以确认重组蛋白识别胆固醇。共聚焦显微镜图像的定量显示，GST-PFO和TOMM20在晚期AD患者的海马神经元中显著共存(图6c)，表明胆固醇在整个疾病过程中在线粒体中积累。
总体而言，作者的数据系统地说明了高胆固醇水平对Aβ诱导的线粒体自噬的影响。胆固醇具有双重作用，它通过下调线粒体抗氧化防御来促进PINK1介导的线粒体自噬，但会损害线粒体自噬体的溶酶体清除。此外，在疾病进展过程中，慢性高胆固醇负荷刺激氧化介导的OPTN聚集体的形成，从而抑制其移位到线粒体和线粒体自噬完成，尽管PINK1/Parkin激活增强。
图6 AD患者海马中的锥体神经元在HDA6C阳性聚集体中显示OPTN，这与高线粒体胆固醇水平有关总 结
作者团队的研究揭示大脑中增加的胆固醇负荷干扰了泛素介导的线粒体自噬过程，导致AD的线粒体清除受损。胆固醇介导的抗氧化性线粒体防御的下调触发了PINK1-Parkin信号通路的激活，最终导致溶酶体分解缺陷导致线粒体的不完全降解。强调了使用特定的脑胆固醇降低策略来恢复溶酶体功能和抑制过量的线粒体ROS，这些策略与自噬诱导剂相结合可能在AD的治疗中具有重要意义。
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Roca-Agujetas V, Barbero-Camps E, de Dios C, Podlesniy P, Abadin X, Morales A, Marí M, Trullàs R, Colell A. Cholesterol alters mitophagy by impairing optineurin recruitment and lysosomal clearance in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2021 Mar 8;16(1):15.
