Mol Psychiatry：中枢神经刺激剂对伏隔核GABA能神经元的精细化调控作用_

神经刺激性药物暴露对伏隔核（NAc）脑区中棘投射神经元（SPNs）的细胞和分子影响已被广泛研究，在所有的NAc神经元中，中间神经元虽然只占很少比例，但其能对SPNs输出施加主导作用，包括在成瘾的情况下。然而，对NAc中间神经元可塑性的转录机制的研究目前还比较少。

表达小清蛋白（PV+）GABAergic中间神经元是局部纹状体环路中强有效的前馈抑制调节剂。在体实验表明，神经兴奋剂药物暴露后PV+中间神经元会强烈放电，并且在戒断期间其兴奋性进一步增强。同时，阻断NAc PV+中间神经元神经递质的释放就能抑制反复苯丙胺（AMPH）暴露所诱发的行为敏化和条件位置偏好。

本文中，作者使用特定细胞类型中标记细胞核分离（INTACT）的转基因小鼠模型，以纯化从PV+和SST+ NAc中间神经元，来研究AMPH暴露后NAc中间神经元染色质和基因表达的调节。

为了分离出不同的NAc中间神经元，作者利用INTACT转基因鼠(Fig.1A-C)和Pvalb-IRES-Cre 或Sst-IRES-Cre品系杂交，便可以标记和分离NAc中PV+和SST+中间神经元(Fig.1D-E)，分为免疫共沉淀结和的部分（IP）和未结合的部分（UF）。

对来自单只的完整纯化的PV+或SST+细胞核进行RNA-seq，并确定与UF相比的DE基因，如图(Fig.1F-I)。最后，IP-富集基因中，中间能神经元marker明显，而UF-富集基因中，SPNs marker Ppp1r1b明显(Fig.1j,k)，这也进一步证明了该分离方法的有效性。

图1：INTACT介导的小鼠NAc中PV+和SST+ GABA能中间神经元的分离

AMPH注射35min后，纯化NAc PV+或SST+中间神经元，来识别AMPH暴露后NAc GABA能中间神经元快速PRGs（初级反应基因），首先AMPH暴露显著增加行为活性，其次nucRNA-seq发现在PV IP、SST IP和SPNs中AMPH依赖的Fos的显著上升(Fig.2A-D)。

同时在三种细胞类型中检测到相对少量的DE基因(Fig.2E-G)。也检测到常见的快速PRG TFs的诱导(Fig.2H)，这说明早期反应转录因子（ERTFs）在所有的细胞类型中都被诱导。

利用RRHO分析捕获到PV+和SST+神经元之间一致的快速转录程序(Fig.2I)，同时也检测到不同细胞类型之间的差异基因，如图(Fig.2J,K)。

图2：AMPH在NAc GABAergic神经元的不同群体中诱导快速PRGs的重叠程序

相对地，作者注射AMPH 3h后进行与上述相同的实验(Fig.3A-C)，来识别由AMPH所调节的延迟PRGs和SRGs（二级反应基因）,Bdnf作为一种延迟PRG，在UF部分中被诱导，但在GABA能中间神经元中不被诱导(Fig.3D)。

在三种不同类型的神经元中识别到大量不同的AMPH诱导的基因(Fig.3E-G)，与快速PRGs程序重叠不同，延迟基因程序几乎完全不同(Fig.3H,I)。Acan编码神经周围网（PNN）蛋白Aggrecan，Aggrecan的敲除会破坏PNN并将PV+神经元转换为高可塑性状态(Fig.3J)，其被AMPH选择性诱导在PV+神经元中。Cntnap4是促进PV+中间神经元突触前释放GABA的neurexin超家族成员(Fig.3M)，其只被AMPK选择性诱导在PV+神经元中(Fig.3k)。

图3：AMPH给药后3小时，在不同NAc GABA能神经元群中，细胞类型特异性基因表达程序的调节

通过对INTACT纯化的神经元核使用转座酶可及性染色质测定法（ATAC-seq）来表征全基因组TF（转录因子）结合的染色质可及性。在未暴露于AMPH的小鼠中，PV+和SST+中间神经元具有独特且可复制的染色质可及性方式，能将它们彼此以及与SPNs分开(Fig.4A-C)。

作者发现，急性AMPH暴露后并未诱导PV+中间神经元或UF中染色质可及性改变(Fig.4E,F)。这种稳定性在控制快速PRG TFs产生的调控元件中也很明显，如Fos(Fig.4G)。即使在反复AMPH暴露后，PV+或UF部分的染色质可及性依然没有显著变化。

图4：NAc神经元中细胞类型特异性和AMPH后染色质可及性

作者利用荧光激活的细胞核分选(FANS)技术从Pvalb-Cre小鼠中分Sun1-GFP标记的核，用于单核RNA测序(snRNA-seq)，并通过主成分分析(PCA)进行了降维，生成了一个UMAP，该UMAP定义了具有Pvalb+核的九个簇(Fig.5A,B)。

Adarb2和Gpc5是Pvalb簇中贡献最大的差异基因，这两者在第4簇中表达最高(Fig.5C)。为了确定AMPH依赖性基因诱导是否发生在PV+神经元的特定子集中，惊讶的是，在Adarb2+子集中，除了Fos略微富集外，快速PRGs几乎没有差异(Fig.5I)。

图5：单核RNA-seq揭示了NAc中PV+中间神经元的分子异质性

NAc中细胞类型特异性染色质可及性的独特形式是否可以揭示与TFs的差异结合位点呢？暴露AMPH 3h后，在PV+、SST+和UF诱导的所有基因中识别差异染色质可及性区域，然后寻找这些区域中富含TF结合基序并匹配到TF家族中(Fig.6B-D)。在所有三种细胞类型中，确定了细胞类型特异性表达的多个TF的结合位点富集。

图6：对AMPH调节基因附近差异可及染色质的基序分析表明NAc神经元中基因调节的转录机制

最后，为了确定PV+中间神经元中的哪些基因可能有助于对滥用药物的行为反应，作者评估了MeCP2 Ser421Ala KI小鼠NAc中的PV+神经元基因表达。发现，MeCP2 Ser421Ala KI小鼠的PV+神经元显示出PV特异性，AMPH诱导基因Cntnap4、Clstn2和Acan的表达升高（Fig.7J-K）。