导读：
淀粉样蛋白(Aβ)多肽在淀粉样斑块中的积聚是阿尔茨海默病(AD)的重要病理特征之一。载脂蛋白E(APOE)基因是晚发性阿尔茨海默病(AD)最强的遗传危险因子，已被证明以一种亚型依赖性的方式影响Aβ在脑内的积聚。虽然已有研究表明，脑内APOE水平的改变可以影响Aβ斑块病理的发展，但目前还不完全清楚特定细胞类型(如星形胶质细胞)产生的载脂蛋白E是如何促进淀粉样蛋白病理的。近期，《Molecular Neurodegeneration》期刊发表了题为“Selective reduction of astrocyte apoE3 and apoE4 strongly reduces Aβ accumulation and plaque-related pathology in a mouse model of amyloidosis”的论文，作者团队揭示了星形胶质细胞apoE3和apoE4在Aβ斑块的沉积和积聚以及与Aβ相关的某些下游效应中的重要作用。
1. 他莫昔芬给药后的apoE水平
为了评估星形胶质细胞apoE的丢失对Aβ病理的影响，作者团队使用ALDH1L1-Cre/ERT2BAC转基因小鼠以他莫昔芬依赖的方式选择性地去除星形胶质细胞中的APOE。建立APPPS1、FE3Cre+和APPPS1；FE4Cre+小鼠(Cre+)，并与APPPS1、FE3Cre-和APPPS1；FE4Cre-小鼠(Cre-)比较，评价Aβ斑块病理改变。每组小鼠在4周龄时(这些小鼠首次形成Aβ斑块前2-4周)每天腹腔注射一次他莫昔芬，连续6天(图1A)。所有的小鼠都接受了相同系列的他莫昔芬注射，包括作为对照的Cre-小鼠。一组Cre+和Cre-小鼠在6周龄时收集，在服用他莫昔芬1周后，没有显示出Aβ病理的迹象(数据未显示)。为了研究他莫昔芬对星形胶质细胞APOE的去除效率，作者首先测定了18周龄的大脑星形胶质细胞中APOE的mRNA和蛋白水平(图1A)。用qPCR检测apoE mRNA水平，与Cre-鼠相比，Cre+组小鼠的apoE mRNA水平显著降低约70%(图1B)。为了评估apoE的水平，在PBS和胍缓冲液中依次提取皮层组织样本，分别测定可溶性和不溶性apoE。与Cre-小鼠相比，所有Cre+小鼠的可溶性apoE水平也显著降低了约50-70%（图1C）。不溶性apoE水平，主要反映apoE在Aβ斑块中的共沉积，与Cre-小鼠相比，Cre +小鼠也显著降低，雌性小鼠降低约75-85%，雄性小鼠降低约60-65%(图1D)。
接下来，作者通过对apoE进行免疫荧光染色来评估他莫昔芬治疗后APOE表达的细胞类型特异性(图1D)。我们观察到，与Cre-鼠相比，Cre+组小鼠皮层和海马区APOE染色强度总体上降低了约60-80%(图1E和F)。由于载脂蛋白E以脂蛋白颗粒的形式分泌到细胞外间隙，因此，细胞内和细胞外载脂蛋白E的结合可能会影响皮层和海马的载脂蛋白E免疫染色的总体强度。此外，斑块主要位于我们研究的年龄的皮层中，因此皮层中APOE染色较强的部位可能来自与淀粉样蛋白沉积相关的APOE。对载脂蛋白E染色的定性评估也显示在GFAP阳性星形胶质细胞中载脂蛋白E的存在明显减少。在Cre-小鼠中，几乎所有GFAP+的星形胶质细胞也呈APOE+，而Cre+的小鼠仅在GFAP+的星形胶质细胞中显示罕见的APOE染色(图1G)。我们还观察到载脂蛋白E仍然存在于IBA1+小胶质细胞中，特别是在Aβ斑块附近(图1G)。因此，他莫昔芬能有效降低Cre+小鼠星形胶质细胞的总APOE水平并显著降低APOE的表达，同时似乎仍然使Cre +小鼠中的小胶质细胞表达APOE。此外，虽然免疫染色显示，Cre+组小鼠的总apoE水平显著降低，仍有与X-34+淀粉样斑块共定位的APOE染色强烈病灶，与Cre-组小鼠相似(图1E和G)。
图1 他莫昔芬给药降低ALDH1L1-CRE+APPPS1；FE3Cre-和APPPS1；FE4Cre-小鼠的ApoE水平
2. 缺乏星形胶质细胞APOE小鼠的Aβ斑块积聚
Aβ在纤维淀粉样斑块中的沉积受APOE的表达水平和亚型的影响。随着星形细胞载脂蛋白E的靶向移除导致总体apoE水平的显著降低，作者调查了这种降低对Aβ在X34+纤维淀粉样斑块中沉积的影响(图2A、S1)。在皮层和海马，APPPS1；FE3Cre+雌性和APPPS1；FE4Cre+雄性和雌性小鼠的纤维斑块负荷显著减少，而雄性APPPS1；FE3Cre+小鼠没有显著差异(图2B和C)。在大脑皮层，雌性Cre+和APPPS1；FE4Cre+雄性的淀粉样蛋白负荷减少了约60-70%，在海马区减少了约75-85%。总体而言，星形细胞apoE丢失的总淀粉样蛋白负荷与APPPS1；EKO小鼠观察到的定性相似(图2B和C)。纤维斑块强度的分析显示，与CRE-小鼠(图2D和E)相比，Cre+小鼠的总强度显著降低，并且表现出更小、密度更低的致密核心。Cre+组小鼠的斑块强度比Cre-组小鼠的斑块强度降低约40-55%。然而，对APPPS1；EKO小鼠的定性评估显示，他们的纤维斑块形成的核心甚至比Cre+小鼠更不致密，强度也更低(图2D和E)。
图2 减少星形胶质细胞apoE可降低纤维斑块水平和斑块强度为了评估总体Aβ沉积，使用抗Aβ抗体进行染色(图3A，S2A)。在皮质中，雄性APPPS1；FE3Cre+小鼠的Aβ水平没有差异，而雌性APPPS1；FE3Cre+小鼠与雌性APPPS1；FE3Cre-小鼠相比，Aβ斑块负荷有降低的趋势(图3B)。对于APPPS1；FE4Cre+小鼠，雄性和雌性小鼠的皮质斑块覆盖率都比APPPS1；FE4Cre-小鼠显著降低了约60%(图3B)。在海马区，Cre+雌鼠的Aβ斑块覆盖率显著降低，减少了约90%(图3C)。有趣的是，对APPPS1；EKO小鼠的定性分析显示，Aβ斑块负荷高于Cre+小鼠(图3B和C)。
为了进一步分析Aβ在大脑中的蓄积情况，作者从匀浆的皮质组织样品中检测了胍基可溶性(PBS不溶性)组分中不溶性Aβ的含量。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胍组分的Aβ40和Aβ42水平。不溶于PBS并在胍组分中检测到的Aβ可用来衡量Aβ在大脑中积累量，并在Aβ聚集后构成Aβ池的大部分。PBS可溶性部分中的Aβ40和Aβ42在各组之间没有差异(数据未示出)。与APPPS1；FE3Cre-雄性小鼠相比，APPPS1；FE3Cre+雄性小鼠的胍组分Aβ40和Aβ42水平无明显差异，而 APPPS1;FE4Cre + 雄性小鼠中的 Aβ40 显著降低了 65%。与Cre-雌鼠相比，Cre+雌鼠的Aβ40和Aβ42水平均显著降低，Aβ40降低约70-80%，Aβ42降低约50-60%(图3D和E)。对Aβ免疫染色与纤维状Aβ斑块形成关系的评估也显示，与Cre-鼠相比，Cre+组小鼠中Aβ沉积的独特模式(图3F，S2B)。在Cre+组小鼠中，纤维状Aβ核心较小，每个斑块中由非纤维状Aβ组成的比例较大(图3F)。然而，与APPPS1；FE3Cre+和APPPS1；FE4Cre+小鼠相比，APPPS1；EKO小鼠的非纤维性Aβ的积累甚至更多、更分散(图3F),为了评估积累的总Aβ中有多少正在形成纤维状淀粉样蛋白结构，将 X-34 染色检测到的纤维状Aβ的量与HJ3.4染色的总Aβ进行比较。HJ3.4免疫染色可检测所有形式的Aβ，因此所有 X-34 阳性Aβ斑块也将通过HJ3.4染色检测，但并非所有用HJ3.4检测到的Aβ都会对X-34呈阳性。因此，将X-34染色量与HJ3.4染色总量进行比较，可以深入了解斑块结构形成的差异。X-34面积与HJ3.4面积的比率显示，雄性Cre+小鼠的X-34面积与HJ3.4面积的比率大约降低了65%，而对于雌性小鼠，只有APPPS1;FE4Cre + 小鼠的比例显著降低约 50%（图 3G）。
图3 减少星形细胞apoE降低Aβ斑块水平并改变Aβ沉积3. 星形胶质细胞apoE缺失后的小胶质细胞活化
小胶质细胞的激活状态已被证明受到apoE亚型和脑内A-β斑块病理的影响。为了更好地了解星形细胞apoE的缺失是如何影响小胶质细胞基因表达的，作者对皮质组织样本进行了RT-qPCR。与FE3或FE4小鼠相比，APPPS1;FE3Cre-和APPPS1;FE4Cre-小鼠分别表现出DAM相关转录物的上调，表明小胶质细胞对淀粉样斑块的反应（图 S3D-J）。APPPS1；FE3Cre+和APPPS1；FE4Cre+小鼠也表现出一些DAM相关基因的上调，但与CRE-小鼠相比，这些Cre+小鼠的几个DAM基因的上调幅度较小(图S3D-I)，包括Clec7a(图S3F)。
图 S3 Cre-、Cre + FE3Cre-、FE3Cre+、FE4Cre-和 FE4Cre + 小鼠中的小胶质细胞基因表达分析
为了评估Cre+小鼠小胶质细胞的总体水平是否发生了变化，潜在地解释了总的DAM基因表达的差异，对大脑切片进行了Iba1染色(图4A)。总体而言，APPPS1；FE3Cre+与APPPS1；FE3Cre-小鼠以及APPPS1；FE4Cre+与APPPS1；FE4Creme小鼠之间的Iba1染色覆盖的皮质面积百分比保持不变(图4B)。然而，与其他组相比，APOE3雌鼠的整体IBA1染色水平确实较低。为了研究Aβ斑块周围小胶质细胞的状态，根据IBA1+小胶质细胞的总数评估了DAM小胶质细胞标志物Clec7a的数量(图4E)。聚集在X-34斑块周围的Iba1+小胶质细胞的数量在Cre-和Cre+组之间没有变化，这表明星形细胞载脂蛋白E的丢失并没有改变小胶质细胞迁移到斑块的能力(图4F)。然而，与Cre-鼠相比，Cre+组小鼠纤维斑块周围的Clec7a水平降低了约50-70%(图4G)。此外，对斑块相关小胶质细胞中APOE(这也是DAM小胶质细胞的一个标志)的存在进行评估也显示，与CRE-小鼠相比，Cre+小鼠的apoE含量显著减少了约60-70%(图4C，D)。Cre+小鼠小胶质细胞APOE和Clec7a水平的降低表明，在星形细胞apoE缺失的情况下，小胶质细胞对淀粉样蛋白病理的反应受损。
图4 星形细胞apoE减少的小鼠小胶质细胞活化减少4. 星形胶质细胞 apoE 缺失后的星形胶质细胞活化
ApoE 已被证明会影响星形胶质细胞的某些功能，包括对致病刺激的反应，但尚不完全清楚星形胶质细胞apoE的细胞特异性缺失是否会改变星形胶质细胞对Aβ斑块的反应性。因此，作者利用RT-qPCR技术研究了星形胶质细胞反应性相关基因的表达谱。Cre-和Cre+小鼠之间反应性星形细胞基因的总体表达几乎没有差异，包括S100β(图5A)。然而，在APPPS1；FE4Cre+小鼠中，GFAP的表达略有下降，但在APPPS1；FE3Cre+小鼠中，GFAP的表达没有下降(图5B)。为了可视化和进一步评估星形胶质细胞的反应性，作者通过免疫染色评估了GFAP的水平(图5C)。与APPPS1；FE3Cre-小鼠相比，APPPS1；FE3Cre+小鼠总的GFAP染色无明显改变。然而，与 APPPS1;FE4Cre- 小鼠相比，雌性APPPS1;FE4Cre+小鼠的皮质中GFAP染色显著减少了36%（图5B和C)。APPPS1;FE4Cre+小鼠中GFAP基因表达和免疫染色的减少可能是由于星形胶质细胞对淀粉样蛋白斑块的反应性改变或淀粉样蛋白负荷的总体减少。因此，为了查看星形胶质细胞反应性是否在Aβ斑块周围发生特异性改变，我们评估了每个斑块15μm内的GFAP染色（图 5C）。各组之间斑块周围的GFAP染色水平没有发现差异（图5E）。星形胶质细胞apoE的缺失并不改变星形胶质细胞对Aβ斑块的反应能力，至少在形态学上不会改变星形胶质细胞对Aβ斑块的反应能力，APPPS1；FE4Cre+小鼠星形胶质细胞反应性的整体改变可能是由总Aβ斑块病理水平驱动的。
图5 APPPS1；FE4Cre+小鼠的星形胶质细胞活化减少5. 星形胶质细胞apoE缺失后的神经炎性营养不良
Aβ沉积在纤维状淀粉样斑块中会损害周围的神经元突起，并导致斑块周围大量肿胀的轴突和树突的形成(神经性营养不良)。这些受损和肿胀的轴突中含有各种蛋白质的积累，这些蛋白质可以作为营养不良的标志，包括BACE1和RTN-3。作者使用一种抗BACE1抗体染色来评估小鼠大脑皮质中营养不良的神经突起的总数(图6A)。雌性Cre+小鼠的BACE1水平比雌性Cre-小鼠显著降低约50-70%(图6B)。由于BACE-1阳性营养不良轴突仅存在于淀粉样斑块周围，这与去除星形细胞apoE后淀粉样斑块的整体减少是一致的。当我们在每个15μm内的斑块来评估BACE1的面积时，发现神经性营养不良在雄性Cre+小鼠中显著增加了约30%，在雌性APPPS1；FE4Cre+小鼠中增加了50%(图6C，D)。为了进一步评估斑块周围的神经性营养不良，还进行了RTN-3的染色(图6E)。在Cre+雌性小鼠中，斑块周围的RTN-3水平比Cre-雌性小鼠高约90-115%(图6F)。
图6 神经炎性营养不良在斑块周围增加，但总体减少，星形细胞 apoE 减少总 结
减少星形胶质细胞apoE3和apoE4导致APPPS1、FE3Cre+和APPPS1；FE4Cre+小鼠的纤维淀粉样斑块和总Aβ斑块沉积显著减少。同时，与APPPS1；EKO小鼠完全丢失apoE相比，星形细胞apoE的丢失导致Aβ沉积的结构和模式发生了独特的改变。此外，星形胶质细胞apoE去除后，纤维斑块周围小胶质细胞活化减少，表明星形胶质细胞apoE可能在调节小胶质细胞对Aβ病理反应中起关键作用。还观察到星形胶质细胞激活的亚型依赖效应，提示星形细胞apoE3可能降低星形胶质细胞的整体激活。最后，虽然Cre+小鼠中看到更加分散的纤维斑块结构被证明可以诱导Aβ斑块沉积部位神经性营养不良的增加，但也减少了星形细胞apoE降低Aβ斑块的能力，导致总体神经性营养不良水平下降。这些结果提供了使用靶向细胞特异性降低星形胶质细胞apoE来改善阿尔茨海默病Aβ病理治疗的潜力。
精读原文链接：
Thomas E Mahan, Chao Wang, Xin Bao, Ankit Choudhury, Jason D Ulrich, David M Holtzman. Selective reduction of astrocyte apoE3 and apoE4 strongly reduces Aβ accumulation and plaque-related pathology in a mouse model of amyloidosis. Mol Neurodegener. 2022 Feb 2; 17(1):13. doi: 10.1186/s13024-022-00516-0.
