撰文 | 刘青青 王珊 重庆医科大学附属儿童医院肿瘤外科
责编 | 周叶斌
神经母细胞瘤（NB）是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤，是致死人数最多的儿童实体瘤。作为儿童胚胎源性肿瘤的代表，神经母细胞瘤有特殊的临床特征：一方面极少数的神经母细胞瘤可以出现自行消退，另一方面高度恶性的神经母细胞瘤在疾病初期即可侵袭周围血管、脏器，并向远处骨、骨髓以及淋巴结转移。独特的临床特征预示着细胞分化可能是治疗神经母细胞瘤的一个潜在方向。然而神经母细胞瘤分化的潜在机制仍有许多未知，需要更多可靠的预后生物标志物来预测神经母细胞瘤的分化轨迹。
单细胞测序可根据检测到的每个细胞的基因表达情况对细胞进行分类，能够揭示组织中细胞的异质性，并发现新的细胞亚群以及构建出完整的细胞谱系，同时基于每个细胞的基因表达情况还可以进行分子层面上的机制研究。
2022年2月4日，重庆医科大学附属儿童医院肿瘤外科王珊 教授团队在 Genes & Diseases 在线发表了题为 Single-cell landscape analysis reveals distinct regression trajectories and novel prognostic biomarkers in primary neuroblastoma 的研究论文。该研究通过临床样本单细胞测序，揭示了NB自发退化的一种新机制，并发现了神经母细胞瘤3个新的预后相关的分子标志物，STMN2、TUBA1A和ITGB1，并通过临床样本验证其在神经母细胞瘤组织中的蛋白表达水平。
研究人员收集了17例神经母细胞瘤患儿手术切除肿瘤样本进行单细胞转录组测序，一共分析了89882个细胞，降维聚类得到9种主要的细胞类型，包括神经内分泌细胞（NEs）、类固醇生存细胞、施旺细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周皮细胞。CNV（拷贝数变异）分析提示NEs是神经母细胞瘤的肿瘤细胞。
对NEs的CNV（拷贝数变异）分析
研究人员探索了NB肿瘤细胞的分化轨迹。结果表明，成纤维细胞和NB肿瘤细胞之间的转化更有可能发生。成纤维细胞可进一步分成4个细胞亚群（Fib-C1、Fib-C2、Fib-C3和Fib-C4），结果显示Fib-C2亚群是NB肿瘤细胞的分化末端状态。最后，研究人员进行了免疫组化验证Fib-C2相关的标记基因CCL2和ZFP36在恶性肿瘤细胞中高度表达。
Fib-C2的标记基因CCL2和ZFP36在肿瘤细胞中高度表达（红色指针处；40倍图从20倍图放大而来）
研究人员通过NMF分析肿瘤细胞聚类得到6个模块。TARGET数据库（154个样本）分析6个模块与神经母细胞瘤预后关系发现模块4有较低的生存周期。进一步对模块4中基因分析后，研究人员确定了两个影响预后的基因STMN2和TUBA1A。临床样本验证TUBA1A和STMN2的蛋白和RNA表达水平，提示STMN2和TUBA1A为神经母细胞瘤新的潜在的预后标志物。
STMN2与TUBA1A表达量与病人预后相关
研究人员进一步发现M2型巨噬细胞中ITGB1基因表达与良好的预后相关，这与其它肿瘤中ITGB1表达与预后不良相关的报道不同，预示该基因在不同肿瘤中可能有不同的作用。临床样本免疫组化验证ITGB1的蛋白表达水平发现，ITGB1在神经母细胞瘤低危组中高表达，高危组中低表达，可能是一个潜在的神经母细胞瘤治疗靶点。
总的来说，该研究通过对不同分期的神经母细胞瘤进行单细胞转录组分析，发现NB肿瘤细胞可能分化为成纤维细胞C2亚群，这揭示了NB自发退化的一种新机制。研究者还通过评估肿瘤内异质性确定了预后标志物（STMN2和TUBA1A）。同时，在肿瘤微环境的M2型巨噬细胞中确定了ITGB1与良好的预后相关，并可能作为潜在的预后分层标志物和治疗靶点。
重庆医科大学附属儿童医院肿瘤外科王珊教授为本文通讯作者，肿瘤外科刘青青博士研究生、王珍妮住院医师和新格元江燕博士为共同第一作者。
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原文摘要（Abstract）
Neuroblastoma (NB), which is the most common pediatric extracranial solid tumor, varies widely in its clinical presentation and outcome. NB has a unique ability to spontaneously differentiate and regress, suggesting a potential direction for therapeutic intervention. However, the underlying mechanisms of regression remain largely unknown, and more reliable prognostic biomarkers are needed for predicting trajectories for NB. We performed scRNA-seq analysis on 17 NB clinical samples and three peritumoral adrenal tissues. Primary NB displayed varied cell constitution, even among tumors of the same pathological subtype. Copy number variation patterns suggested that neuroendocrine cells represent the malignant cell type. Based on the differential expression of sets of related marker genes, a subgroup of neuroendocrine cells was identified and projected to differentiate into a subcluster of benign fibroblasts with highly expressed CCL2 and ZFP36, supporting a progressive pathway of spontaneous NB regression. We also identified prognostic markers (STMN2, TUBA1A, PAGE5, and ETV1) by evaluating intra-tumoral heterogeneity. Lastly, we determined that ITGB1 in M2-like macrophages was associated with favorable prognosis and may serve as a potential diagnostic marker and therapeutic target. In conclusion, our findings reveal novel mechanisms underlying regression and potential prognostic markers and therapeutic targets of NB.
DOI: 10.1016/j.gendis.2021.12.020
