导读
自噬是溶酶体降解的主要途径，通过构成性转化废弃的蛋白质和细胞器来维持细胞的内稳态。阿尔茨海默病（AD）中的自噬功能明显受损。近日，Ju-Hyun Lee 等人在《Nature Neuroscience》期刊上发表了题为“Faulty autolysosome acidification in Alzheimer's disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques”的文章，揭示了五种AD模型小鼠体内神经元独特的自噬失调，并使用神经元特异性的自噬和pH的转基因mRFP-eGFP-LC3探针、多重共聚焦成像和相关的光学电子显微镜来确定其基础。早在细胞外淀粉样蛋白沉积之前，神经元中的自噬溶酶体酸化程度就下降了，这与vATP酶活性显著降低和扩大的去酸化自噬溶酶体中Aβ/APP-βCTF的选择性积累有关。在更多受损但仍完整的神经元中，大量Aβ阳性的自噬空泡（AVs）堆积成大的膜泡，形成花状的核周花环。这种独特的模式被称为PANTHOS，也存在于AD的大脑中。更多的AVs合并成膜小管的核周网络，其中纤维状β-淀粉样蛋白在管腔内聚集。溶酶体膜通透性增强，组织蛋白酶释放，溶酶体细胞死亡，并伴有小胶质细胞的侵袭。定量分析证实，在淀粉样前体蛋白AD模型中，表现为PANTHOS的单个神经元是老年斑的主要来源。
检测体内ALP功能障碍
THY-1启动子驱动的串联mRFP-eGFP-LC3转基因（tfLC3）在出生后在神经元中特异性表达。tfLC3的表达水平比内源性LC3水平大约高一倍，并且对自噬-溶酶体途径（ALP）没有可检测到的影响。像内源性LC3那样，tfLC3与自噬体（AP）膜结合，并在AP-LY融合后作为内在化底物在AL内降解，最终产生非荧光溶酶体（LYs）。AP上的tfLC3在AP的中性pH下发出黄绿色荧光（eGFP/mRFP），但是与LY融合后的自溶体（AL）成熟使AL酸化，导致荧光从黄色转变为橙色，然后转变为红色，因为eGFP荧光在pH 6.0以下被淬灭。用第三个荧光团标记的LY标记物（如组织蛋白酶D（CTSD）或LAMP 2）进行免疫组织化学荧光（IHF）标记，可以显示在荧光LC3自噬清除后或在新的LY生物发生之后的LYs。值得注意的是，这第三个荧光团也将发黄色荧光的AP与融合了LY的AP区分开来，该AP是组织蛋白酶阳性的，但是不能充分酸化，因此通过单独的tfLC3标记发黄色荧光（图1a）。后者被分类为酸化不良的AL（pa-AL）。
在TRGL小鼠的原代神经元培养中，当从AP到AL的转变在逆行轴突运输过程中延长时，AP成熟和酸化最容易被意识到（图1b）。在完整的成熟大脑中，AV的数量要少得多。完全酸化的AL集中在神经元的核膜和近端树突内（图1c，箭头）。在新皮质核周体的三荧光团（RGB）分析中，ALs发出紫色荧光（红色和蓝色的组合），反映了有效的核周体酸化机制（图1d，顶部）。为了在体内模拟AL/LY酸化缺陷并验证tfLC3探针在体内完整的大脑中的有效性，6月龄的TRGL小鼠通过脑室输注了两亲性弱碱氯喹（CQ）或单独的载体（对照）5天，并对新皮质层III-V中的神经元进行成像（图1d）。当囊泡pH高于6.0时，tfLC3阳性的斑点发出黄色荧光。仅基于绿色/红色通道合并，这些点将被错误识别为AP；然而，具有CTSD抗体和Alexa Fluor 647二抗的IHF将这些斑点鉴定为CTSD阳性，因此鉴定为pa-AL。在三通道合并中，它们发出白色荧光（绿色、红色和蓝色荧光）（图1d，RGB合并底部），与正常神经元中的紫色酸化的AL形成对比（图1d，RGB合并顶部）。LYs在CQ后保持蓝色，反映了它们对被IHF检测到的pH不敏感（图1d）。计算机算法根据三种荧光团的色调角度和饱和度来确定每个囊泡的相对贡献，这是比视觉感知更精确的“颜色”（和囊泡特性）的客观表示。
图1.TRGL小鼠脑内双标记自噬传感器的设计和表达AL酸化不足出现在β-淀粉样蛋白沉积之前
我们将TRGL小鼠与Tg2576小鼠杂交，后代是一种在10~12个月大时开始出现β淀粉样斑块的AD模型。1.6个月大的Tg2576/TRGL杂交后代中的ALP模式与单TRGL同窝出生的小鼠无法区分；然而，到5个月大时，除了酸化ALs之外，超过90%的新皮质III-V层周质已经获得黄色荧光AVs。CTSD联合标记显示了黄色AVs仅是CTSD阳性的，因此是pa-ALs（图2a，下图）。pa-AL对于CTSB和溶酶体膜蛋白LAMP1也是阳性的。在新皮质中基于色调角的AV亚型分配和量化显示，Tg2576/TRGL的pa-ALs（每个神经元横截面9.0±0.5）比TRGL（2.1±0.3）多4倍，成熟ALs明显较少（每个神经元横截面4.4±0.4对6.6±0.3）（图2b），pa-ALs和ALs的大小增加（1.3±0.04对0.48±0.03和1.75±0.09对0.74±0）。到12个月时，Tg2576/TRGL中的核周蛋白进一步增加（每个神经元横截面17.2±0.7）（图2e，f）。为了进一步证明Tg2576大脑中的AL酸化缺陷，我们通过OptiPrep密度离心分离了AL/LY的组分,并测定了它们的ATP酶活性。与观察到的pH缺陷一致，6月龄的Tg2576小鼠的比年龄匹配的同窝出生的野生型（WT）小鼠相比降低（65.6±4.1%）（图2d），并且在Tg2576小鼠12个月大时脑中LY/AL中的vATP酶活性进一步降低（相对于WT为45.3±3.7%）（图2g）。另外两种AD小鼠模型（5xFAD和APP51）的脑中的ATP酶活性类似地降低。时间进程图表明pa-AL的年龄依赖性增加，而vATP酶活性下降（图2h）。
图2.AL酸化缺陷在AD模型小鼠中早期发生，并随着年龄的增长而进展在疾病早期APP-βCTF/Aβ在pa-AL中积累
在AD中，β淀粉样蛋白沉积在细胞外之前，APP-βCTF和Aβ在细胞内积聚，内体-溶酶体系统代表了它们产生的主要亚细胞部位。为了将APP-βCTF/Aβ在Tg2576小鼠细胞内积聚与早期AL酸化缺陷联系起来，我们使用检测APP-βCTF和Aβ的单克隆抗体（JRF/AβN/25）定位AV亚型内的致病性淀粉样前体蛋白（APP）代谢物。Tg2576/TRGL小鼠中40%的III-V层新皮质周膜含有Aβ/APP-βCTF阳性斑点（图3a），根据CTSD共免疫标记和四种荧光团的成像（图3a，箭头和图3b），其几乎完全是pa-AL（88.6±2.4%）。对来自Tg2576脑亚细胞组分的免疫印迹分析证实，富含LAC3-II的AV组分含有丰富的APP-βCTF以及γ分泌酶组分（早老素1和尼卡司他素）（图3c）和Aβ。Aβ1-42抗体（JRF/cAβ42/26）进一步验证了Aβ在AVs中的定位。此外，使用改进的Duolink技术（方法）通过原位邻近连接试验（PLA）进一步验证了APP-βCTF在AVs中的定位，该技术涉及针对APP-βCTF上不同表位（N-末端或C-末端）的两种一抗（图3d）。PLA荧光（红色）在APPswe过表达的N2A细胞和Tg2576神经元中检测到APP-βCTF，其水平显著高于对照组（图3e，箭头）。值得注意的是，PLA信号（蓝色）显示APP-βCTF选择性地积聚在Tg2576/TRGL外周酸化不良的ALs中（92.9±1.3%，n = 50个神经元）（图3f）。
图3.AD小鼠神经元内APP-βCTF/Aβ选择性地在pa-AL中积累逐渐受损的神经元大量积累pa-AL
在10个月大的Tg2576/TRGL小鼠中，一个新皮质神经元亚群（III-V 层）开始积累显著增大的 pa-AL，使质膜向外凸出（图4a，放大的右侧面板，箭头）。LC3囊泡的进一步大量增殖伴随着大的强荧光膜泡的形成，该膜泡从质膜突出并扩大核周周长。缺乏LC3荧光的中央核区域（图4a）可以用核标记物标记，包括DAPI、组蛋白H3或核纤层蛋白A/C（图4b，c）。在这个核区域没有自体荧光排除了DAPI信号是非特异性淀粉样蛋白引起的自体荧光的可能性。受影响的核周体中的大多数AVs通过IHF检测为LY标记阳性，表明它们是pa-ALs（图4d），这反映了AL成熟和酸化的严重不足。
我们在五种不同的AD小鼠模型中观察到了相同的自噬神经变性模式，包括加速神经病理学发作（5xFAD，TgCRND8和PSAPP）或延迟发作（Tg2576和APP51一种表达hAPPwt的异常延迟发作模型）的模型（图4e）。5xFAD/TRGL小鼠在早期（2个月后开始，取决于性别）（出现了强烈的ALP破坏和神经元变性，并且比Tg2576或APP51小鼠具有更高的重现性。我们使用该模型进一步研究LC3阳性膜泡的发展与疾病进展之间的关系，包括定量淀粉样斑块病理学。据我们所知，类似的巨大的充满AV的核周膜突起，如在超微结构上进一步的定义那样（图5），之前未被描述为处于神经退行性状态。因为这些围绕中央DAPI阳性细胞核的大荧光泡的玫瑰花结类似于花瓣，我们将这种独特的退化过程称为PANTHOS，并将受影响的细胞称为PANTHOS神经元。
图4.在五种不同的AD小鼠模型，tfLC3探针揭示了一种独特的自噬应激、AL pH缺陷和质膜泡（‘PANTHOS’）的模式
PANTHOS是AD中一种独特的神经退行变性模式
tfLC3探针提供的自噬图谱的更高分辨率使我们能够通过共聚焦成像观察到充满AV的滤泡直接从PANTHOS神经元的核周细胞质通过向核周中心逐渐变细的颈部延伸（图5a）。对5xFAD/TRGL小鼠脑的电子显微镜（EM）分析证实了泡与核周细胞质的连续性，并鉴定AVs为泡内的主要成分（图5b）。核周滤泡显示出从PANTHOS神经元的胞体延伸的长的膜结合的颈部（图5c，方框I，用箭头标出的轮廓）。在更高的EM分辨率下，PANTHOS神经元的其他特征包括位于中心的辐射膜结合管状延伸的电子致密网络，其包含部分融合和完全整合的AVs（图5c，方框ii：黄色箭头）以及强Aβ免疫反应性的6nm纤维束（图5c，方框ii）（图6d，方框ii）。在其他EM图像中，可以看到AVs和含Aβ阳性纤维的管状延伸物正在融合（图5d）。对溶酶体酶酸性磷酸酶（ACPase）的组织化学标记的脑切片的EM分析进一步证实了滤泡中的大多数AV为强ACPase阳性ALs，包括连接滤泡和退化核周细胞质的锥形滤泡颈内的AV（图5e，插图：黄色箭头）。尽管核周滤泡的不对称形态及其明显的细胞质来源使其区别于局部肿胀（营养不良）神经突（DNs），但滤泡进一步区别于富含神经丝的DNs，表现出溶酶体标记物（CTSD和LAMP2）的弱信号，并且与PANTHOS神经元周围的核周滤泡相比很少。
为了进一步确定许多AV填充的泡状轮廓的核周起源，我们使用Apreo扫描电子显微镜进行了相关光电子显微镜（CLEM）和系列块面扫描电子显微镜成像。超过500个z平面图像的重建在三维空间中重建了整个PANTHOS神经元。从370到430的感兴趣区（ROI）区域的堆叠EM图像序列（图5F）证实，早期PANTHOS轮廓的大小接近正常神经元的大小（图5g），但是随着核周滤泡更加广泛，这些轮廓的周长扩大了（图5h）。PANTHOS神经元的DAPI阳性中心区域近似于堆叠的EM图像中电子密集的中心区域的大小（图5g）。使用核标记KDM1/LSD1的免疫电镜分析通过检测相同中心区域中的强烈的免疫反应，即使在核完整性被广泛破坏之后，也证实了中心区域中核残余物的存在。通过这些连续切片的图像序列清楚地显示了几十个充满AV的膜泡，这些膜泡在细胞质内从锥形颈部产生，从核周体扩展成大的球状突起（泡），如全套的彩色切片所示（图5h）。3D重建模型显示了核周体广泛的气泡（图5i）。PANTHOS神经元是淀粉样斑块的主要来源。在5xFAD/TRGL小鼠中，在β-淀粉样蛋白斑块出现之前，Aβ和APP-βCTF在pa-ALs内选择性积累（图6a，箭头），如Tg2576小鼠（图3）。神经元向PANTHOS模式的转变伴随着核周Aβ/APP-βCTF免疫反应性的增强。用DAPI和抗β-淀粉样蛋白抗体（4G8）对这些PANTHOS神经元进行共标记，在最受影响的周核中心的DAPI阳性核残余物周围鉴定出4G8阳性冠状物（图6b）。在晚发性AD小鼠模型APP51中，进一步证实了与β-淀粉样蛋白积聚相关的PANTHOS形成的进展。
图5.AD小鼠模型中PANTHOS神经元的超微结构特征PANTHOS神经元是淀粉样斑块的主要来源
在5xFAD/TRGL小鼠中，在β-淀粉样蛋白斑块出现之前，Aβ和APP-βCTF在pa-ALs内选择性积累（图6a，箭头），与Tg2576小鼠（图3）一样。神经元向PANTHOS模式的转变伴随着核周Aβ/APP-βCTF免疫反应性的增强。用DAPI和抗β-淀粉样蛋白抗体（4G8）对这些PANTHOS神经元进行共标记，在最受影响的核周中心的DAPI阳性核残余物周围鉴定出4G8阳性冠状物（图6b）。在晚发性AD小鼠模型APP51中，进一步证实了与β-淀粉样蛋白积聚相关的PANTHOS形成的进展。
在5xFAD/TRGL小鼠中，PANTHOS神经元中央区域的定量光谱分析将DAPI荧光与4G8免疫标记产生的荧光区分开（图6c）。在PANTHOS的更晚期，随着更多的β-淀粉样蛋白在中央积聚，DAPI荧光逐渐消失。超微结构和3D6免疫电镜（IEM）分析将这种Aβ免疫反应性的中心增生（图6d）定位在神经元内膜性管状轮廓（图6d，方框I）内。在许多这些相同的分布图中，宽度约为10 nm的3D6阳性原纤维束接近原纤维β-淀粉样蛋白28的已知直径（图6d，方框ii）。类似于图5b中的PANTHOS形态，具有3D6的PANTHOS神经元的Aβ IEM额外检测到3D6阳性的AVs填充到核周滤泡中。还显示核周AVs与膜管状结构的中央Aβ阳性网络连续并整合到其中（图6e）。带有LC3或CTSD抗体的IEM证实这些空泡是AVs（扩展数据图6e）。内质网（ER）是AP膜成分的关键来源，由于AD脑中自噬诱导仍然很高，ER越来越多地被动员为新的AP提供膜。然而，随着积累的AVs耗尽可用膜的来源，富含APP的er和高尔基膜加入内体成为APP-βCTF/Aβ产生的主要来源。因此，ER和高尔基体可能是淀粉样纤维网络扩张的关键贡献者，通过贡献膜和β-淀粉样前体支持AP/AL的形成。
与PANTHOS是淀粉样斑块的主要来源一致，在5xFAD/TRGL小鼠中用3D6免疫标记β-淀粉样蛋白显示了单独的PANTHOS神经元和单独的淀粉样斑块之间的排他性共存和一对一的定量关系（图7a）。所有PANTHOS神经元为3D6阳性，并且在PANTHOS损伤中可检测到脑中总3D6信号的91.7±0.01%（n = 3只小鼠，105个神经元和94个损伤计数）（图7b）。此外，在来自2.7月龄的5xFAD/TRGL小鼠（图7d）的皮质中91.4±1.29%（n = 6，每只小鼠两个切片）的PANTHOS病变中可检测到DAPI阳性核信号，包括核周中心的浓缩或碎片化/扩散信号（图7c）。在较老的小鼠（6月龄）中，尽管神经胶质侵入和晚期神经变性，67.8%的PANTHOS神经元仍然显示DAPI核信号（图7d）。这个百分比可能是一个低估值，因为用核标记KDM1/LSD1进行的免疫电镜分析显示，即使在核完整性丧失后仍有核残留（扩展数据图5e）。因此，泛素、细胞内核周Aβ增生和淀粉样斑块形成之间的时间及1：1空间关系表明，绝大多数淀粉样斑块起源于相应的PANTHOS神经元。从完整的有核PANTHOS神经元向DAPI消失的更高级阶段的过渡，伴随着细胞的神经胶质侵入，可能代表了细胞完整性的丧失和向细胞外斑块的转化。
图6.AD小鼠模型脑内PANTHOS神经元内β-淀粉样蛋白增生和分布的演变溶酶体通透性促进神经元的细胞死亡
据报道，溶酶体碱化促进溶酶体膜通透性和组织蛋白酶释放到胞质中。与来自WT同窝出生小鼠的脑相比，来自6月龄的5xFAD小鼠的脑的胞质中的溶酶体酶水平显著增加（图7e）。溶酶体酶渗漏在6月龄的大脑中可检测到，但在年幼（2.7月龄）的大脑中检测不到，此时受影响的神经元要少得多。我们使用CTSD IHF进一步研究了泛素化酶与溶酶体膜通透性的关系。与调整后的正常神经元（图7f，箭头）相比，PANTHOS神经元（图7f，箭头）在用CTSD共标记的5xFAD/TRGL小鼠脑中显示出弥漫性CTSD免疫反应性。我们排除了涉及caspase-3介导的凋亡细胞参与，因为PANTHOS神经元是caspase-3阴性的。
图7.PANTHOS神经退行性病变与β-淀粉样斑块的形成和随后的溶酶体神经元细胞死亡相一致在AD模型中PANTHOS神经元演变为老年斑
为了描述PANTHOS神经元损伤向成熟斑块的演变，我们用硫黄素S （Thio-S）免疫标记PANTHOS，用于检测致密核心老年斑（图8a）。在2.2月龄的5xFAD/ TRGL的定量分析中，一半的PANTHOS谱是硫代-S阳性的，而在6月龄的5xFAD/TRGL小鼠中，超过95%是硫代-S阳性的（图8a，曲线图）。为了进一步描述PANTHOS神经元病变向成熟斑块的演变，我们免疫标记了反应性星形胶质细胞和小胶质细胞。两种神经胶质细胞类型最初都很少与PANTHOS神经元相关，因此，这些细胞不太可能是PANTHOS发育的主要触发因素。在2.7月龄的5xFAD/TRGL的定量分析中，大多数PANTHOS神经元未与小胶质细胞或星形胶质细胞接合（图8b）。在年龄较大的5xFAD/TRGL小鼠（6月龄）中，当更大量的PANTHOS神经元表现出结构完整性的高度丧失时，相对较少的受影响神经元未与小胶质细胞和星形胶质细胞接合（图8b）。
在较老的5xFAD小鼠中，当相邻的PANTHOS神经元合并成包含多个硫代-S阳性致密核心（图8d）的单个较大结构（图8c）时，PANTHOS损伤经常扩展成较大的老年斑。在这些生长的病变中，新招募的PANTHOS神经元仍然可以被识别，但是原始PANTHOS神经元及其相邻神经元的完整性的丧失产生了持续β-淀粉样蛋白的扩展中央核心，因为其他细胞碎片被清除，最终产生了扩大的细胞外致密核心老年斑（图8b），由z-stack共聚焦成像证实。
图8.在AD模型中，PANTHOS神经元演变成典型的致密核心老年斑
小结
作者团队的发现增加了越来越多的证据表明溶酶体酸化和vATP酶复合物的失调是与神经退行性疾病相关的遗传和代谢破坏的共同靶点。结合之前的证据，他们的发现有力地支持了阿尔茨海默病中APP代谢物和LY功能障碍之间的致病联系。值得注意的是，通过各种方法修复PSEN1相关的溶酶体pH缺陷可改善AD模型中的自噬衰竭和其他AD相关的病理。预计转基因双荧光tfLC3自噬探针具有广泛的潜力，可以在其他神经退行性疾病模型中灵敏地表征ALP随时间的变化，并促进自噬/溶酶体调节剂作为治疗剂的评估。
原文链接：Lee JH, Yang DS, Goulbourne CN, Im E, Stavrides P, Pensalfini A, Chan H, Bouchet-Marquis C, Bleiwas C, Berg MJ, Huo C, Peddy J, Pawlik M, Levy E, Rao M, Staufenbiel M, Nixon RA. Faulty autolysosome acidification in Alzheimer's disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques.Nat Neurosci. 2022 Jun;25(6):688-701.
