Nat Neurosci系统总结：突触前的光遗传学_

近年来，随着光遗传学技术的发展，其在神经科学领域的应用越来越广泛。得益于其对靶向目标的专一性，操纵时间上的快速性和精确性，相比于化学遗传学等其他的方法，光遗传学成为操纵突触前神经递质释放的最佳方法。然而，由于光遗传学工具多种多样，在使用前需要了解它们的特性以及它们靶向目标的特性。

Ofer Y教授团队据此总结了光遗传学工具在突触前的种类和应用策略，并将其成果“Optogenetics at the presynapse”于2022年7月发表于Nature Neuroscience 杂志。

光遗传学工具的生物物理特性

目前使用的光遗传学工具主要分为三类：视紫红质、蓝光受体（BLRs）以及光敏剂。视紫红质包含了一个7个螺旋的膜蛋白（视蛋白），视黄醛发色团镶嵌其中并与视蛋白共价结合，光刺激后视黄醛会出现构象改变，从而改变其状态。

视紫红质分为I类（微生物型）视紫红质和II类（动物型）视紫红质，其中I类又分为光敏通道蛋白（ChRs，被动转运的离子通道)，光驱动的离子泵（主动转运）以及酶视紫红质，II类则是特异性被光激活的G蛋白偶联受体（GPCRs），也可以分为视觉型视紫红质（视感蛋白、视锥蛋白）和非视觉型视紫红质。

BLRs使用黄素作为发色团，有黄素单核苷酸（FMN），黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及核黄素，BLRs可以控制多个效应蛋白，在光消失之后，也会存在残留的暗活性，无法做到精准的时间控制，主要应用在植物和细菌中。BLRs可以分为光-氧-电压域（LOV）、蓝光传感器利用FAD域（BLUF）以及隐花色素（CRYs）。

遗传编码的光敏剂都源于拟南芥向光素2的绿色荧光蛋白或者LOV2区域，照射后，会产生活性氧，单线态氧会氧化多种氨基酸侧链，从而在20-150nm光下使相应的蛋白质失活（原位发色团辅助光失活(CALI)）。

图1.光遗传致动器概述

靶向光遗传学驱动器于轴突和突触前

由于大部分的光遗传学工具都源自于种系发生很远的物种，在哺乳动物细胞中缺乏定位信号，因此经常会导致光遗传学工具无效的膜定位，细胞内聚集以及高浓度时的细胞毒性。

目前没有通用信号序列用于靶向光遗传学工具于轴突和突触前，但是有两种机制可以促进轴突定位：一是通过胞体树突部位优先胞吞的单向膜插入，二是通过特异性囊泡进行的轴突导向的转运，例如将光遗传学工具融合到突触素中，可以促进它在突触前细胞质或者突触囊泡腔的表达升高（图2）。

图2.光遗传致动器的轴突运输和突触前靶定

光遗传学工具在突触前的应用

光敏通道辅助的环路映射（CRACM）主要促进突触前释放，其策略是将阳离子型ChR（CCR）表达于突触前，之后光照射目标区域，导致轴突膜去极化，从而产生动作电位（AP），之后AP引起钙离子内流，从而导致突触前释放，同时检测突触后的电流，从而观测两者之间的功能连接。

但CRACM也存在问题，即AP产生之后，向下传导的同时，也会逆向传导，导致侧枝突触前释放，使得体内CRACM实验结果变得复杂。在体外脑切片中，可以通过同时抑制突触前钠离子和钾离子通道，使光照后目标区域有钠离子内流的同时不产生AP，并激发钙离子内流从而释放神经递质。

在生物中可以通过局部注射利多卡因或者特异性阻断突触后受体来达到上述效果。相比于电刺激，光刺激突触前末端会产生更大的突触后反应，而且不同的实验流程、不同的通路以及不同的细胞类型，光遗传学刺激的效果都可能不同（图3）。

图3.通过CCR刺激导致的光诱导的神经递质释放的概念和缺陷

光遗传学抑制神经递质释放则有3种策略：

其一，通过外向的质子泵（ArchT, Arch3, Jaws)或者内向的氯离子泵（NpHR）使轴突膜超极化从而抑制AP的传播，降低突触前钙离子内流。递质传递的降低在光照瞬间发生，并在照明终止后的几秒钟内消失。这种方法适合快速抑制的实验，因为一旦时间加长（几分钟）就会产生其他非预期效应。

其二，通过GPCRs抑制神经递质释放，突触前的GPCRs本身就是天然的突触前释放抑制剂，GPCRs有3个不同的亚基，α，β和γ，β和γ亚基可以与电压门控的钙离子通道（VGCCs）相互作用从而降低它的开放概率，此外，这两个亚基可以直接干扰SNARE介导的囊泡与膜融合，抑制突触前释放。非视觉型II类视紫红质与G蛋白偶联受体偶联，且不会产生光漂白的现象从而可以成为有效的抑制突触前释放的工具（optoGPCRs），目前描述地最多的是来自八目鳗的侧视蛋白（LcPPO）以及来自蚊子的OPN3。

其三，由光敏剂介导CALI（InSynC）系统以及AsLOV2衍生的iLID二聚体系可以直接损伤释放装置，损伤囊泡释放相关蛋白从而抑制突触前释放。相比上述两种方式，该方式的起效时间和持续时间都比较长，而且由于该方法直接损伤相关蛋白，因此恢复时间会根据不同的部位以及相关蛋白合成时间的长短而不同（图4）。