背景
帕金森病（PD）患者以运动缺陷为主要临床表现，如运动迟缓和静止性震颤等，目前尚没有能够减缓帕金森病进展的改良疗法。NLRP3炎性小体属于核苷酸结合结构域（NBD）和富含亮氨酸重复序列（LRR）的蛋白质家族, 是先天免疫系统的主要组成部分。由胞质模式识别受体 NLRP3、衔接蛋白ASC和Caspase-1 (Casp1) 组成的蛋白复合物。已明确小胶质细胞NLRP3炎性小体过度活化会导致PD非细菌性炎症反应，但在神经退行性疾病中神经元炎性小体激活的病理机制尚未阐明。
2022年5月25日，美国约翰霍普金斯大学医学院的Panicker等研究人员在Neuron杂志发表了题为“Neuronal NLRP3 is a Parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson's disease”的研究论文。该研究发现在小鼠和人多巴胺（DA）神经元中，E3泛素连接酶Parkin活性丧失引起神经元自发性NLRP3炎性小体组装，导致DA神经元死亡。Parkin通过泛素化和靶向NLRP3蛋白酶体降解来抑制炎性小体的启动。Parkin活性丧失有助于另一种泛素化底物ZNF746/PARIS的积累，并产生线粒体活性氧(MitoROS)，从而激活NLRP3炎性小体复合物组装。
结果
一、Parkin耗竭后DA神经元内NLRP3炎性小体激活导致DA神经元的丢失
1.Parkin耗竭后DA神经元内NLRP3炎性小体被激活
首先，研究者将AAV GFP-Cre通过立体定位方式注射到Parkinflx/flx小鼠的黑质致密部（SNpc）建立成年发病模型，即造成DA神经元特异性Parkin耗竭。为评估炎性小体的启动和激活，研究人员做了免疫印迹与免疫组织化学实验，结果显示，相比于AAV GFP对照组，AAV GFP-Cre注射组Parkin不表达，而NLRP3 和裂解的半胱天冬酶1（Casp1）水平均增加（图1B）。免疫组织化学 (IHC)结果显示Parkin耗竭导致DA 神经元中 Casp1 活性显着上调以及炎性小体组装的标志物ASC 斑点的形成（图1D），而小胶质细胞无此改变（图 1C），表明Parkin耗竭的神经元中NLRP3 炎性小体自发激活。
为验证DA神经元Parkin缺失自发地引起细胞炎性小体激活，研究人员通过Casp荧光抑制剂 (FLICA)染色以评估Casp1活性。在小鼠的饲料中加入口服脑渗透剂PLX5622以消耗小胶质细胞后，再对成年发病型DA神经元的Parkin进行耗竭。相比于同窝对照组，治疗组DA神经元中NLRP3和裂解的Casp1水平没有变化（图1F，G），表明小胶质细胞不影响炎性小体激活。
免疫印迹分析显示，与同基因对照(iCont)人类DA (hDA)神经元相比，Parkin缺陷型hDA神经元中NLRP3和裂解的Casp1水平增加（图1H）。辛二酸二琥珀酰亚胺 (DSS) 交联试验显示Parkin缺陷型hDA 神经元ASC寡聚化增加。此外，FLICA 染色测得Casp1活性增加（图1J），表明NLRP3炎性小体被激活组装成复合体 (图1I)。
图1. 多巴胺（DA）神经元特异性Parkin缺失引起NLRP3 炎性小体自发激活。2.成人型DA神经元内NLRP3炎性小体激活足以导致DA神经元的丢失
为评估DA神经元中NLRP3炎性小体激活的影响，将AAV GFP或AAV GFP-cre立体定向注射到8-10周龄NLRP3 A350VneoR小鼠SNpc两侧（在cre-重组酶表达细胞中表达muckle- well相关A350V突变NLRP3基因），3个月后取中脑黑质进行IHC，结果表明TH表达的多巴胺能神经元约为80%GFP阳性，而Iba-1阳性的小胶质细胞中GFP信号较少(图2B和2C)。
免疫印迹分析显示，与AAV GFP注射侧相比，AAV GFP-Cre注射侧裂解的Casp1增加(图2D)。此外，TH和Nissl染色显示AAV GFP- cre侧DA神经元受损(图2E和2F)。这些结果表明，细胞自发性NLRP3炎性小体激活足以驱动DA神经元死亡。
图2.SNpc DA神经元特异性NLRP3炎性小体激活足以驱动DA神经元死亡二、预防炎性小体激活可防止Parkin相关的神经元退行性变
3.Parkin使神经元NLRP多泛素化有助于蛋白酶体清除
为评估Parkin和NLRP3蛋白是否相互作用，研究者进行GST pull-down实验发现GST标记的Parkin可以下调重组NLRP3蛋白，表明两种蛋白直接相互作用(图3A)。在WT小鼠脑裂解物中Parkin与NLRP3发生共免疫沉淀，而Parkin-/-或NLRP3-/-小鼠无此现象(图3B)。在SH-SY5Y细胞内泛素化实验证明，Flag标记的NLRP3可以被myc标记的Parkin泛素化，同时Flag信号呈拖尾现象，进一步证明Parkin介导NLRP3多泛素化修饰（图3C）。
通常Parkin保持自抑制构象，需要PINK1激酶才发挥功能。研究人员通过构建缺乏E3泛素连接酶活性的C431S Parkin或引入一种突变（所有赖氨酸残基突变为精氨酸）HA，使Parkin不能掺入多聚泛素链中，从而阻止Parkin介导的 NLRP3泛素化。人类PINK1显示低激酶活性,而鞘翅目昆虫赤拟谷盗 PINK1 (Tribolium castaneum PINK1, Tc PINK1)具有良好的激酶活性，可用于体外激酶实验。
体外泛素化实验表明，TcPINK1激活WT Parkin从而使NLRP3蛋白泛素化。Parkin自身泛素化以及NLRP3泛素化被非活性TcPINK1或突变C431S Parkin阻断（图3D）。通过串联泛素结合实体(TUBE)pull-down实验，在iCont组中检测到NLRP3信号，但在Parkin缺陷型hDA 神经元中无信号，表明DA神经元NLRP3是一种Parkin多泛素化底物（图3E和3F）。
为证明Parkin介导NLRP3多泛素化导致其降解，研究者使用了放线菌酮(CHX) 追踪分析。在Flag-NLRP3和myc标记的WT Parkin共转染的SH-SY5Y细胞中，Flag-NLRP3的半衰期显着降低，而myc-C431S Parkin的过表达延长了Flag-NLRP3的半衰期（图3G）。
此外，在iCont和Parkin缺陷的hDA神经元中进行CHX追踪分析，发现Parkin缺陷时NLRP3的半衰期明显延长。WT-Parkin介导的Flag-NLRP3清除可以在用蛋白酶体抑制剂MG-132预处理后被逆转（图S3H），表明Parkin通过蛋白酶体介导 NLRP3的清除。总之，这些结果表明DA神经元Parkin在NBD结构域内泛素化NLRP3，靶向它进行蛋白酶体降解。
图3.NLRP3是Parkin多泛素化的底物4.与Parkin相互作用的底物ZNF746 (PARIS)通过增加mitoROS促进NLRP3炎性小体组装
先前研究表明，PARIS介导的线粒体生物合成抑制，导致Parkin缺乏时发生线粒体缺陷。为了评估PARIS在DA神经元炎性小体激活中的作用，研究者将AAV shRNA-PARIS（或AAV con-shRNA）与AAV GFP-Cre起注入Parkinflx/flx小鼠，以防止Parkin缺失后PARIS激活，图4A）。FLICA分析以及TH/Iba-1染色显示，联合注射AAV GFP-Cre和AAV shRNA-PARIS的小鼠DA神经元Casp1活性显著降低(图4B)。免疫印迹数据也证实了上述小鼠脑裂解物中Casp1和Gasdermin-D水平显著下降(图4C)，而单独注射AAV GFP-Cre或AAV shRNA-PARIS组中NLRP3活性无明显变化，这表明DA神经元炎性小体的启动和激活是独立的过程(图4C)。
为评估（CRISPR/ cas9介导的）PARIS基因敲除hDA神经元中，NLRP3炎症体的启动和激活，采用DSS交联法和免疫印迹法检测，研究者发现在Parkin缺陷的hDA神经元中，ASC寡聚以及Casp1和Gasdermin-D裂解水平显著降低，NLRP3活性无显著改变 (图4D)。FLICA染色验证了降低PARIS水平阻止了Parkin缺陷的hDA神经元的Casp1激活(图4E)。这些结果表明，在Parkin基因敲除的DA神经元中，NLRP3炎性小体激活的第二步需要PARIS。
图4.PARIS促进炎性小体在Parkin耗尽的DA神经元中的激活5.预防炎性小体激活可防止Parkin相关的神经元退行性变
为确定NLRP3是在Parkin 缺失时驱动DA神经元Casp1激活的主要炎性小体传感器。将AAV NLRP3-shRNA(或非靶向AAV对照shRNA)和AAV GFP-Cre一起引入Parkin flx/flx小鼠，以防止Parkin 缺失后NLRP3激活。免疫印迹分析(图5A)和FLICA染色实验，发现在体内敲除NLRP3完全抑制了Casp1的激活。免疫印迹和IHC证实了在DA神经元（而不是小胶质细胞）中NLRP3敲低 (图5A)。通过TH/Nissl染色和体视学分析评估，NLRP3降低可防止成年发病型Parkin 缺失介导的DA神经元丢失(图5B和5C)。
此外，与同窝对照Parkinflx/flx/Casp1+/+小鼠相比，成人发病型Parkin 耗尽的Parkinflx/flx/Casp1-/-小鼠存在显著增加的TH阳性DA神经元，提示敲除Casp1具有神经保护作用(图5D和5E)。IHC和PI染色结果显示，Casp1基因敲除可阻止Parkin缺陷型hDA神经元TH表达减少和细胞死亡(图5F-5I)。
图5.阻止炎性小体激活可以防止Parkin相关神经元死亡三、在α-Syn PFF模型中，Parkin活性丧失导致DA神经元NLRP3炎性小体依赖性神经退行性变
6.在α-Syn PFF模型中，Parkin活性丢失激活DA 神经元NLRP3炎性小体
将预先形成的α突触核蛋白原纤维（α-Syn PFF）注射到小鼠纹状体建立散发性帕金森病模型。注射α-Syn PFF后，Parkin被灭活从而导致Parkin底物积累和线粒体缺陷。
在α-Syn PFF模型中，免疫印迹分析显示NLRP3和裂解的Casp1显著上调，表明伴随Parkin活性降低，NLRP3炎性小体启动和激活(图6B)。FLICA分析以及对TH和p-S129 a-Syn进行双重免疫染色发现，在注射α-Syn PFF小鼠的DA神经元中，Casp1活性和病理性α-Syn的标志物p-S129 α-Syn免疫染色显著增加(图6C)。IMARIS重建共聚焦图像显示，在注射α-Syn PFF的小鼠TH阳性DA神经元内，p-S129 α-Syn和Casp1活性均增加 (图6D)。
因观察到PARIS积累驱动线粒体缺陷，研究者通过免疫印迹检测裂解的Casp1水平(图6E)，以及FLICA分析来评估α-Syn PFF注射的WT和PARIS缺陷小鼠的DA神经元中炎性小体激活(图6F)。上述两种方法的实验结果都表明，在小鼠α-Syn PFF模型中，DA能神经元的炎性小体激活需要PARIS。
图6.在α-Syn PFF模型中，Parkin活性丧失导致DA神经元NLRP3炎性小体依赖性神经退行性变7.在α-Syn PFF模型中，Casp1-/-小鼠的DA神经元未发生退行性改变
为探讨神经元炎性小体激活是否参与了α-Syn引起的DA神经元病理性变性，将α-Syn、PFF和PBS立体定向注射到Casp1+/+和Casp1-/-小鼠的背侧纹状体。6个月后，TH和Nissl染色并计数发现，与Casp1+/+小鼠相比，α-Syn PFF注射Casp1-/-组TH和Nissl阳性细胞明显增加(图6G和6H)。爬杆实验和握力测试显示，α-Syn PFF注射的Casp1-/-小鼠保持前肢和全肢力量，无运动缺陷(图6I和J)。免疫印迹分析显示，注射α-Syn PFF的Casp1-/-小鼠纹状体中TH表达显著改善，Triton X不溶性部分的寡聚体α-Syn的积累减少和p-S129α-Syn水平降低(图6K)。
这些结果表明，病理性α-Syn引起Parkin失活，促进神经元NLRP3炎性小体的启动和激活，这种激活依赖于PARIS，并且激活的Casp-1参与了DA神经元的退变。
8.死后PD患者DA神经元中NLRP3炎性小体激活
对死后PD患者和年龄相匹配的对照组中新鲜冷冻的脑SNpc分析显示，PD患者Parkin自泛素化减少，NLRP3、PARIS和裂解的Casp1水平显著上调(图7A)。免疫组化显示，SNpc中存活的TH神经元中NLRP3的水平显著升高(图7B)。FLICA分析以及IHC结果显示，PD患者DA神经元Casp1活性上调，ASC斑点的形成增加(图7C)。此外，还观察到 SNpc中非DA细胞ASC斑点阳性(如图7D)。
图7.死后PD患者DA神经元的NLRP3炎性小体激活该研究为帕金森病多巴胺神经元中NLRP3炎性小体启动和激活机制提供了新证据，Parkin的缺失通过上调PARIS激活多巴胺神经元中的NLRP3炎性小体的组装和Casp1的激活，从而发生DA神经元退行性改变。其他因素，如蛋白稳态失衡或改变Parkin底物也可能干扰并促进神经元NLRP3 炎性小体的启动和激活。
因此，阻止神经元NLRP3炎性小体激活的策略有望成为PD和其他神经退行性疾病中针对细胞自主死亡机制进行疾病修饰治疗的重要途径。
参考文献
Panicker, Nikhil et al. “Neuronal NLRP3 is a parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson's disease.” Neuron, S0896-6273(22)00450-0. 25 May. 2022, doi:10.1016/j.neuron.2022.05.009
编译作者: 香蕉牛奶 (Brainnews创作团队)
校审: 胖兔子可可 (Brainnews编辑部)
