突触可塑性是神经系统的一个基本特性，被广泛认为是学习记忆和各种认知情感行为的主要机制。长期的可塑性可以双向改变突触强度，导致长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）。已知突触强度的改变可能发生在突触两侧。突触后可塑性涉及突触后受体数量或特性的变化，而突触前可塑性通常涉及神经递质释放的改变。目前，大量的突触可塑性研究集中在突触后机制。相比之下，突触前LTP机制的研究比较少，集中在两个方面。首先，突触前钙内流，调节钙内流的突触前离子通道和受体的激活，以及钙依赖的cAMP产生是突触前LTP必需的。其次，SNARE系统及相关蛋白的激活导致递质释放的快速改变。斯坦福大学的Thomas Südhof教授是这方面的主要研究者，阐明了许多突触前递质释放相关蛋白的功能，因此获得了2013年的拉斯克医学奖和诺贝尔生理学或医学奖。但是，上述研究是两个完全脱离的层次，因此钙信号/cAMP信号激活如何影响递质释放不明。
图1. Thomas Südhof教授和突触前递质释放相关的蛋白框架Südhof教授的研究中，RIM1蛋白是一个递质释放的决定性分子，也是其获得诺贝尔奖的主要成就之一。2003年，Südhof教授与约翰霍普金斯的Daivd Linden教授（著名小脑研究科学家）合作在Cell发表论文，利用培养细胞电生理揭示了RIM1α的一个磷酸化位点（Ser413）可以被PKA磷酸化，并控制LTP的诱导产生。这项研究是令人兴奋的，因为结果首次将诱导突触前LTP的两个信号层次联系起来。然而，Südhof教授和其他实验室的后续研究发现，Ser413变义突变小鼠的小脑和海马突触前LTP完全正常。这样，RIM1α-Ser413和PKA在突触前LTP的核心作用受到了质疑。那么，什么信号机制介导了RIM1α在突触前LTP的激活呢？这个问题是理解突触前可塑性的核心。
2023年4月26日，浙江大学医学院沈颖教授团队在国际知名期刊《eLife》在线发表题为“cAMP−EPAC−PKCε−RIM1α signaling regulates presynaptic long-term potentiation and motor learnin”的研究论文，最终解开了这个谜团。该研究发现cAMP的另一种底物，EPAC（exchange protein directly activated by cAMP）可以结合PKCε（epsilon isozyme of protein kinase C），触发以前未知的Rim1α苏氨酸磷酸化；EPAC-PKCε轴可以调节递质的突触前囊泡的锚定，并且是诱导LTP必需的；更重要的是，突触前LTP对运动学习至关重要。正如三位评审人和编辑一致指出的“这项研究提供了广泛的令人信服的实验证据，是一项非常有意思的新发现，回答了突触前LTP机制的关键问题”。
图2 发表文章截图研究团队首先通过大量的磷酸化检测，证明cAMP或EPAC可以导致RIM1α的苏氨酸磷酸化，而不是以往认为的丝氨酸磷酸化。由于EPAC本身缺乏激酶活性，团队又证明EPAC可以与PKCε结合形成复合体，激活EPAC显著增加PKCε的丝氨酸磷酸化，激活PKCε。接着，团队利用小脑颗粒细胞特异性Cre在突触前敲除EPAC或者PKCε，结果显示两者都显著降低RIM1α的苏氨酸磷酸化。这些数据首次发现RIM1α存在快速的苏氨酸磷酸化，并且EPAC和PKCε对于RIM1的苏氨酸磷酸化是必要和充分的。
研究团队进一步研究了EPAC−PKCε−RIM1α对突触递质释放的作用。首先利用电镜观察EPAC或者RIM1α敲除小鼠的递质囊泡分布，发现缺失EPAC或RIM1α都显著降低了突触囊泡的锚定。接着进行膜片钳记录和高频率突触前刺激，计算了可释放囊泡库（RRP）和突触释放概率（Pr），发现EPAC或PKCε的缺失极大地减小了RRP和Pr。研究人员又通过蛋白相关性研究，证明了EPAC−PKCε模块促进Rab3A-RIM1α-Monc13-1三元复合物的形成，从而调节递质囊泡的锚定。
然后，研究团队进行了大量的高难度的电生理记录，在突触前敲除EPAC或者PKCε小鼠诱导浦肯野细胞的三种突触可塑性，包括突触前LTP、突触后LTP和突触后LTD，并在多个条件下重复验证（高龄、生理温度和低钙）。结果表明，突触前的EPAC−PKCε信号轴是诱导突触前LTP所必需的，突触后LTP和突触后LTD则不需要突触前的EPAC−PKCε信号。因此，这些实验阐明了突触前LTP的完整信号机制，回答了以往不明的科学问题。团队工作还讨论了以往PKA作用于突触前LTP的争论，通过可信的证据证明PKA也参与了cAMP诱导的递质释放增加，只是其作用远小于EPAC−PKCε信号轴所起的作用。
神经科学研究中，一个长期不明的问题是突触前LTP对个体行为的作用，一个原因是缺乏可信的突触前LTP动物模型。证实了EPAC−PKCε信号轴在突触前LTP中的关键作用后，研究团队继续研究突触前LTP在一个经典的小脑相关学习中的作用，即前庭小脑眼反射（VOR）。研究人员发现，突触前敲除EPAC或者PKCε都可以导致VOR相位反转学习的显著缺陷。这些结果清楚地表明突触前LTP对于运动学习至关重要。
图3.课题提出的突触前LTP机制模式图总结来说，这项研究聚焦于突触前的cAMP−EPAC−PKCε−RIM1α模块，证明EPAC可以诱导PKCε激活和RIM1α苏氨酸磷酸化，促进Rab3A−RIM1α−Monc13-1三元复合物的组装，介导突触前囊泡活性区的锚定和递质释放。诱导突触前LTP需要EPAC−PKCε模块的激活，并且对于依赖于前庭小脑的运动学习至关重要。由于EPAC和PKCε在大脑中广泛表达，因此EPAC−PKCε模块可能对其他脑区的突触前可塑性和相关学习行为很重要。
浙江大学医学院沈颖教授与荷兰Erusmus大学的Chris De Zeeuw教授、美国弗吉尼亚大学的Julius Zhu教授是本文的共同通讯作者，杭州师范大学副教授（原浙江大学博士后）王新泰、浙江大学附属邵逸夫医院特聘副研究员周琳、浙江大学博士生董斌斌是共同第一作者。该研究受国家自然科学基金杰出青年基金和面上基金、科技创新2030项目等资助。
