导读：
睡眠不足与老年人群的认知能力下降有关，这也是阿尔茨海默氏病的一个危险因素。免疫调节基因(如编码2型髓细胞上表达的触发受体的基因(TREM2))在去除致病性 Aβ 斑块和调节大脑神经退行性变中的关键作用，近期华盛顿大学医学院奈特阿尔茨海默病研究中心的David M. Holtzman研究团队在《 SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE》 期刊发表了题为“Sleep deprivation exacerbates microglial reactivity and Aβ deposition in a TREM2-dependent manner in mice”的论文，文章研究睡眠不足是否以及如何影响小鼠的小胶质细胞功能。研究结果揭示了睡眠剥夺可以直接影响小胶质细胞的反应性， 从而导致进一步的 Aβ 沉积。
01
小鼠睡眠剥夺时 Aβ 斑块沉积增加是 TREM2 依赖性的
一些研究报告称， 不同程度的睡眠不足会导致淀粉样蛋白的积累增加。然而，免疫调节基因对睡眠/觉醒状态的影响，以及这些基因是否影响 Aβ 斑块沉积对睡眠不足的反应尚不清楚。为了研究慢性睡眠剥夺对 Aβ 斑块病理的影响， 作者使用了表达人源化TREM2常见变异的5xFAD小鼠(5xFAD/
T2CV
)、功能缺失的R47H变异体(5xFAD/T2R47H)或 TREM2 基因敲除小鼠(5xFAD/T2KO)， 在小鼠 2.5个月大时，即Aβ斑块开始出现在大脑中，就开始了剥夺睡眠实验(
图 1A
)，并持续了6 周以上，之后对小鼠实施安乐死，以研究大脑中早期斑块沉积的变化。作者观察到与正常睡眠的5xFAD小鼠相比，睡眠百分比(P= 0.026)(
图 1B
)和睡眠时间(
P
图 1C
)减少，证实了小鼠的睡眠被剥夺了。进一步的分析显示， 与黑暗阶段相比，光照阶段的睡眠百分比降低了，而在睡眠剥夺小鼠的睡眠时长， 也有类似的模式（图 S1.A-D）。与此相一致的是，在睡眠剥夺后，立即通过脑电图（EEG）测量的清醒时间减少（图 S1E)（P= 0.001），睡眠被剥夺的小鼠表现出非快速眼动睡眠的增加。这是长时间睡眠不足后睡眠反弹的迹象。为了消除压力作为一个潜在的混淆杂因素，作者测量了血浆皮质酮，发现睡眠剥夺小鼠与正常睡眠对照小鼠相比没有变化， 这表明作者的睡眠剥夺方法对压力没有重大变化(图 S1F) 。与之前的报道一致，作者发现， 与正常睡眠的对照小鼠相比， 慢性睡眠剥夺使小鼠大脑下带中被小分子X34染色的纤原性 Aβ 斑块(P= 0.002)和总体免疫阳性的Aβ斑块负担(P=0.006)增加了约两倍。虽然没有统计学意义， 但作者观察到睡眠剥夺后5xFAD/T2KO小鼠的X34+纤维斑块与5xFAD/T2KO正常睡眠对照组相比略有增加(P=0.715)。这可能潜在地反映了淀粉样蛋白沉积早期饱和的平台期，因此在这些小鼠中缺乏睡眠剥夺的进一步影响。免疫阳性Aβ斑块积累的增加仅出现在睡眠剥夺的5xFAD/T2CV小鼠中，而在 TREM2功能丧失的5xFAD/T2R47H小鼠和5xFAD/T2KO小鼠中未发现。然而，与 5xFAD/T2CV小鼠相比5xFAD/T2KO小鼠的 Aβ 积累更高(P= 0.047)。考虑到5xFAD小鼠模型在这个年龄主要在枕下形成斑块，睡眠剥夺引起的斑块沉积的最强影响在枕下最为突出，其次是丘脑核和皮质区域，尽管程度较轻(图 S2)，但在这些区域可以观察到斑块沉积的类似变化。总之， 这些发现表明， 在 5xFAD小鼠模型中， 正常的 TREM2 功能对于调节 Aβ 沉积很重要， 并且 TREM2 的功能是睡眠剥夺影响淀粉样蛋白沉积所必需的。
图1 睡眠剥夺加剧了 5xFAD 小鼠淀粉样斑块的沉积02
睡眠剥夺后的小胶质细胞反应性加剧依赖于TREM2
由于小胶质细胞的趋化性和斑块关联随着 TREM2 功能的丧失而受损，作者接下来通过检查反应性和稳态小胶质细胞标记物的变化来研究睡眠剥夺是否影响小胶质细胞功能(图 2)。我们发现，在睡眠剥夺后，表达P2RY12(图 2A 和 D)和 TMEM119(图 2A和E)的稳态小胶质细胞群明显减少，但仅在T2CV组(PP=0.0028)和5xFAD/T2CV组(P=0.039和P=0.038)中。与不积累 Aβ 斑块的 WT小鼠相比，5xFAD组在托下呈现出更大范围的离子钙结合受体分子 1 (IBA1)阳性小胶质细胞(图 2B和C)。与正常睡眠的5xFAD/T2CV对照组相比，睡眠剥夺的5xFAD/T2CV小鼠中，Aβ 斑块周围的 IBA1+小胶质细胞聚集更为突出，而在功能丧失的5xFAD/T2R47H或 5xFAD/T2KO小鼠中没有观察到这一点(图 2C和 I，图 S2)。这表明睡眠剥夺诱导的小胶质细胞反应性具有TREM2依赖性。作者观察到睡眠剥夺5xFAD/T2CV小鼠丘脑核和皮质中X34+斑块沉积、IBA1+小胶质细胞和 CD68+溶酶体中类似的TREM2依赖性变化，尽管其程度低于枕下(图 S2)。作者还评估了睡眠剥夺是否影响Cd33和Bmal1的表达， 这两者都在作用在神经胶质免疫反应和细胞代谢中起重要作用，后者直接影响昼夜小胶质反应。作者没有发现不同基因型或睡眠条件之间的变化(图 S2L和M)。在对照条件下，5xFAD组的 IBA1染色面积百分比未显示TREM2基因型依赖性变化，可能是因为他们年龄小;然而，与5xFAD/T2KO小鼠相比，5xFAD/T2CV小鼠中 IBA1+小胶质细胞紧密聚集在Aβ斑块周围的比例更高(P=0.044)(图 1)。睡眠剥夺后小胶质细胞形态的变化进一步支持了小胶质细胞反应性的差异，注意到每个细胞分支数量减少，皮层细胞体大小增加，与此年龄的枕下相比，其中存在的Aβ斑块明显减少(图 S2)。与此相一致的是，在睡眠剥夺的5xFAD/T2CV小鼠中，小胶质溶酶体 CD68 免疫染色(PP=0.045)升高(图 2B，G，F和 H)，表明睡眠剥夺导致小胶质功能下降。这些小胶质细胞标记物的变化，无论是稳态的还是反应性的，并不是沉积斑块的小鼠所独有的，因为这些变化也存在于T2CV小鼠中(图 2和图S2)。与5xFAD组相似，睡眠剥夺后WT小鼠仅在功能性TREM2存在的情况下观察到小胶质细胞反应性的变化，这表明TREM2依赖于小胶质细胞对睡眠变化的反应(图 2和图S2)。总的来说，这些发现表明，在 Aβ 斑块存在或不存在的情况下，TREM2 在慢性睡眠剥夺反应中促进功能失调的小胶质细胞表型都是必需的。
图2 睡眠剥夺会根据 TREM2 的表达来改变小胶质细胞的反应性CD68和Iba1染色的小胶质细胞在枕下Aβ斑块周围的三维(3D)重建图像显示，尽管5xFAD/T2CV小鼠睡眠剥夺后斑块周围的小胶质细胞反应性增加，这些小胶质细胞吞噬了纤维状Aβ斑块，但在它们的溶酶体中积累了这种物质(P=
0.008)(图 3A 和B)。这支持了作者的假设，即睡眠剥夺会导致小胶质细胞功能失调， 尽管向斑块募集了大量的反应性小胶质细胞，但在降解或吞噬大脑中的 Aβ斑块方面效率低下。此外，即使在没有斑块的情况下，也观察到类似的反应性小胶质细胞状态(图 2 和图 S2)。因此，作者进一步研究了睡眠剥夺小鼠与正常睡眠对照组小鼠的小胶质细胞在功能上是否在聚集或降解Aβ的能力上存在差异。作者首先剥夺T2CV和5xFAD/T2CV小鼠6周的睡眠，在脑内注射488染料标记的Aβ原纤维，然后在注射后2天对小鼠实施安乐死，对比睡眠变化后小胶质细胞功能的急性影响(图 3C)。在注射 Aβ 原纤维之前，我们通过透射电镜验证了它们荧光团标记前后对比的性质(图 3D和E)。我们发现，在T2CV小鼠(P=0.020)和5xFAD/T2CV小鼠(P=0.054)中，IBA1+小胶质细胞大量聚集在外源接种的Aβ 488原纤维周围，与正常睡眠的对照组小鼠相比，睡眠剥夺小鼠的小胶质细胞中有更多的标记原纤维(图 3F和G)。这些发表明，当面临Aβ原纤维等挑战时，缺乏睡眠的小鼠脑内小胶质细胞的功能受到损害，因为小胶质细胞不仅与对照组相比反应过度，而且无法有效地降解被吞噬的物质。为了进一步评估这一假设，作者接下来检查了溶酶体。
图3 睡眠剥夺会导致小胶质细胞内 Aβ 的增加03
睡眠剥夺后小胶质细胞和神经元的异常溶酶体蛋白积累
大脑中CD68+小胶质细胞的增加通常表明，由于溶酶体活性增强，小胶质细胞吞噬能力增强，例如，作为对淀粉样斑块的反应。考虑到观察到睡眠剥夺引起的淀粉样斑块负担增加和CD68+小胶质细胞增加，而这些细胞中纤维状 Aβ 增加， 作者假设小胶质细胞介导的Aβ降解可能受损，无法应对睡眠剥夺引起的代谢应激引起的细胞需求。为了证实这一假设，作者使用透射电镜研究了溶酶体形态，发现慢性睡眠剥夺导致溶酶体增大，但仅在没有淀粉样斑块的情况下(图 4A-C)。正如预期的那样，5xFAD/T2KO小鼠的溶酶体面积比5xFAD/T2CV小鼠大得多(PT2CV或 T2KO对照组相比， 睡眠剥夺的 T2CV小鼠不仅表现出变形和肿胀的溶酶体形态(图 4B)，而且含有更多带有电子密集包涵体的溶酶体(图 4C)。同样，睡眠剥夺所引起的溶酶体变化仅在T2CV小鼠中观察到，而在T2KO小鼠中没有观察到，这表明存在TREM2依赖性作用。作者进一步验证了溶酶体活性的变化，通过免疫印迹检测溶酶体蛋白水解功能中重要的几种蛋白质，包括但不限于与自噬体融合、货物运载和水解酶活性依赖的消化(图 4D-K)。根据透射电镜数据，作者发现睡眠剥夺对溶酶体蛋白有TREM2依赖的影响，在没有淀粉样斑块的T2CV小鼠中有更大的影响。因为小胶质瘤常伴有溶酶体组织蛋白酶表达升高。因此，作者假设，在睡眠不足的 T2CV组中，溶酶体腔内的水解酶亚型组织蛋白酶B和D的水解酶活性会随着小胶质细胞反应性的增加而增加。然而，作者发现， 在睡眠不足的小鼠中， 增强的小胶质细胞反应则具有相反的效果。在睡眠剥夺的T2CV(分别PPT2CV小鼠(分别 P=0.002和P=0.0003)中， 组织蛋白酶B和D总体上减少(图 4F和G)，尽管转录因子EB (TFEB)增加，特别是在T2CV小鼠中(P= 0.002)(图 4J)。这表明 TFEB 可以补偿由睡眠剥夺引发的溶酶体功能受损。组织蛋白酶B和D都显示成熟改变(图 4D-G)，表明溶酶体消化产物的酶活性受损。据此，作者研究了溶酶体形态和蛋白酶的变化是否影响自噬体的形成(图 S3)。被剥夺睡眠的T2CV小鼠显示出更多的不完全融合的自噬体溶酶体(P=0.06)(图 S 3A 和C)，部分融合的双膜双分子层与自噬体与溶酶体对接一致(图 S3B)，与先前报道的相似。此外，由于TFEB对于自噬过程和受损溶酶体的清除至关重要，作者进一步检测了LC3b，发现与正常睡眠的对照组(P=0.038)或其他TREM2基因型相比，缺乏睡眠的T2CV小鼠的LC3b水平更高(图 4D，E 和 K)。这些发现提供了进一步的证据，证明睡眠剥夺会引起发炎大脑的溶酶体功能障碍，特别是在没有淀粉样斑块病理的情况下。
图4 睡眠剥夺后的溶酶体损伤依赖于TREM2的表达由于作者观察到睡眠剥夺后溶酶体形态和蛋白质变化的TREM2依赖性作用，作者旨在确定这些变化是否仅限于小胶质细胞。作者检测了生理条件下小胶质细胞中丰富的溶酶体标记物，如溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)、组织蛋白
酶B和D，以及IBA1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元核标记物(NeuN)，分别检测了小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的共定位(
图 5
)。缺乏睡眠的T2CV小鼠在 NeuN+神经元、IBA1+和GFAP+小胶质细胞和星形胶质细胞中分别显示出较大的 LAMP1+点(
图 5A-D
)。在缺乏睡眠的T2R47H或T2KO小鼠中没有出现类
似的变化，这支持了溶酶体对睡眠剥夺引发的代谢应激做出反应需要功能性
TREM2的假设。尽管在T2CV小鼠中，睡眠剥夺后三种细胞类型的LAMP1共定
位都增加了，但在形态学上最明显的是神经元，与正常睡眠的对照组小鼠相比，
共定位总体增加了约 50%(
图 5A和D
)。与我们在图 4 中的结果一致， 与5xFAD
组相比睡眠剥夺后T2CV小鼠LAMP1免疫反应性的变化更为突出。无论TREM2
基因型如何，5xFAD小鼠在睡眠剥夺后LAMP1共定位没有变化，这表明在存在
或不存在 Aβ 斑块的情况下，LAMP1+溶酶体对睡眠剥夺依赖性代谢应激的反应
是不同的。与这些结果一致，与其他基因型正常睡眠的对照组相比，只有在睡眠
剥夺后的T2CV小鼠中发现组织蛋白酶B和D的减少(
图 5E-L
)。共定位的减少
仍在神经元和小胶质细胞中更为突出。与正常睡眠的T2CV小鼠相比，缺乏睡眠
小鼠的小胶质细胞(P=0.0035)和神经元(P=0.007)的组织蛋白酶B总体上都减少
了(
图 5F和G
)。这些数据表明，在没有Aβ斑块的情况下，睡眠不足是一种主
要的代谢应激源，损害了小胶质细胞溶酶体的功能。特别是在功能失调的小胶质
细胞存在的情况下，这也可能导致神经元无法处理和排泄底物造成额外负担。
图5 睡眠剥夺后的溶酶体损伤依赖于TREM2的表达04
在Aβ斑块存在或不存在的情况下，睡眠剥夺会触发不同的转录通路
作者观察到T2CV和5xFAD/T2CV小鼠在睡眠剥夺后均出现反应性小胶质样表型(图 2和图 S2)，尽管溶酶体表型在T2CV小鼠中最为突出(图 4和5)。因此，作者旨在研究将两组小鼠在睡眠剥夺反应中区分出来的机制。此外，由于作者主要观察了TREM2对睡眠剥夺的依赖作用，作者的目标是明确对功能性TREM2是否存在所涉及的转录途径。大量海马组织的RNA测序显示，与正常睡眠的对照组相比，睡眠不足的人有明显的转录特征，溶酶体的变化是唯一T2CV和5xFADd /T2CV小鼠之间的共同功能通路(图 6)。我们发现，作者发现基因表达的变化不仅与基因型有关，而且与睡眠的变化有关(图 6A)。正常睡眠与睡眠剥夺T2CV和5xFAD/T2CV小鼠的基因本体(GO)通路在存在或不存在β 斑块方面是不同的(图6B-E )。T2CV小鼠睡眠剥夺导致基因表达的变化主要与溶酶体相关,如Atp6v0a1、Npc1、Ctsd、Laptm5、Cd68和Lamp1，以及小胶质细胞和IL-2信号通路，包括但不限于P2ry12、Aif1、Slc2a9、Clcn7、Tmem119、Sec22c和Rab29。作者还发现了几个参与自噬的基因，如Atg16l、Nlrp6、Lgals8和Becn1，这进一步表明睡眠剥夺会导致溶酶体降解和物质积累的损伤(图 6C-G)。比较5xFAD/T2CV小鼠的不同睡眠状态，发现Aβ病理特有的一组基因通路的变化更为温和，如syndecan-1通路、胶原生物合成、细胞外代谢以及胰岛素样生长因子如 Col8a1、Col8a2, Col3a1, Fmod, Igfr1, Igfr2,Irs4,Ctnnb1和Cdh1(图 6C-G)。睡眠不足的 5xFAD/T2CV小鼠也表现出小胶质细胞和巨噬细胞基因的上调， 尽管这是Aβ斑块病理所特有的，如Clec7a, Clec10a, Ccl4, Cst7, Mgl2 和 Itgae(图 6C-G)。尽管在T2CV和5xFAD/T2CV组中，由于睡眠不足导致的大多数基因表达变化是独特的，但唯一共同的存在是溶酶体和小胶质基因。为了更好地了解所观察到的影响是否主要依赖于TREM2基因型，而不是由于睡眠剥夺，作者比较了睡眠剥夺 5xFAD/T2CV与正常睡眠 5xFAD/T2CV对照的转录组，以及正常睡眠5xFAD/T2CV与 5xFAD/T2KO小鼠的转录组(图 6B)。作者发现两组之间有 9 个基因重叠，包括Bhmt、Cd68、Clec7a、Col8a1、Col8a2、Igf2、Irs4、Mpzl2和Slc47a1(图 6B，F和G)。虽然睡眠剥夺依赖的基因表达变化并不完全依赖TREM2，但睡眠剥夺对炎症的影响在 TREM2 表达的小鼠中大量存在， 这表明需要 TREM2 介导对睡眠剥夺的反应。
图6 睡眠剥夺触发了依赖于 TREM2 和 Aβ 斑块的转录通路05
睡眠不足会引起蛋白质组的变化
尽管睡眠剥夺后基因表达发生了独特的变化，但T2CV和5xFAD/T2CV 小鼠在大脑中表现出相似的炎症特征。因此，作者进一步研究了睡眠缺失是否会导致蛋白质组的整体变化，通过使用无偏差质谱分析脑脊液来确定与睡眠和TREM2基因型相关的独特或相似的蛋白质水解过程是否存在Aβ斑块,无论TREM2表达或斑块病理如何，睡眠不足主要影响所有组的代谢过程(图 7)。然而，与作者之前的结果一致，参与代谢过程的特定蛋白质是TREM2和Aβ斑块所特有的。例如，睡眠不足引起的内溶酶体蛋白的变化途径、刺激炎症反应和转化生长因子-β (TGF-β )信号通路，如Eef1a2、Rab5b、Ctsd、Il6st、Cxcl16、Cd207、Megf10、Ppp2cb、Fbn1、Mapk3 和rock1，在没有 Aβ 斑块的情况下都存在(图 7A-B)。相比之下， 睡眠不足的5xFAD/T2CV小鼠在糖酵解、腺苷三磷酸酶(ATPase)结合和胰岛素信号通路代谢过程中表现出额外影响，如Hk2、Pygl、Fbp1、Atp6v1e1、Atp1a4、Aldh1b1和Apoc3(图 7C-D)。与 5xFAD/T2KO小鼠相比，无 TREM2小鼠中睡眠剥夺诱导的CSF蛋白质组变化主要影响T2KO小鼠自噬、鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性和泛素介导的蛋白水解相关的代谢途径。这方面的例子包括Mtor、Atg4b、Usp26、Rab1、Rab18、Ube2e1和Mtif2(图 7D-G)。作者还分别比较了睡眠剥夺T2CV组和睡眠剥夺T2KO组，通过消除睡眠剥夺作为这些比较中观察到的任何影响的唯一因素，以更好地了解Aβ病理的贡献(图 S4)。每个比较都共享了不同基因型和睡眠条件下特定蛋白的差异调节，包括 Sox5、Fgl2、A1Bg、Enpp6、Neug、Clca、Nrp1 和Lmnb1(图 7和图 S4)。在比较睡眠剥夺的T2CV和睡眠剥夺的 5xFAD/T2CV 小鼠时， 我们仍然观察到代谢功能障碍的变化， 这表明即使在每个个体基因型的睡眠剥夺引起的变化已经显示出代谢障碍的情况下，Aβ 病理也进一步促进了代谢失衡。相比之下，代谢功能障碍不是睡眠剥夺T2KO小鼠与睡眠剥夺5xFAD/T2KO小鼠中观察到的蛋白质组变化的主要因素。这表明，在睡眠不足的大脑中，TREM2 不仅需要引发蛋白质组学变化，而且Aβ病理的存在也可能对进一步加剧代谢功能障碍有害。然而， 在缺乏TREM2的情况下，Aβ 病理并没有进一步加重已经由睡眠剥夺引发的功能障碍。综上所述，这些数据表明，尽管TREM2或β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)等其他遗传因素可能补偿或影响睡眠不足引发的特定途径， 但睡眠不足最终会导致代谢功能障碍。
图7 睡眠剥夺诱导小鼠脑脊液蛋白质组的代谢失调06
小 结
总之， 作者的研究结果表明， 慢性睡眠不足在调节小胶质细胞炎症和代谢反应以及大脑中Aβ 斑块负担方面起着关键作用。这项研究提出了关于绘制疾病进展早期变化的重要问题，并表明睡眠不足、Aβ 、TREM2和小胶质细胞反应性之间存在相互作用。进一步的机制研究可以评估小胶质细胞功能的增强是否可以防止这些细胞和其他细胞因睡眠不足而受损。需要前瞻性的人体研究来测试通过治疗潜在的睡眠障碍来改善睡眠质量是否可以降低小胶质细胞的反应性、淀粉样蛋白沉积的长期风险以及AD患者观察到的认知障碍的进展。了解睡眠如何调节这些复杂的神经胶质相互作用，将为哪些分子途径可能最适合针对睡眠障碍和神经退行性疾病的早期治疗干预开辟新的途径。
精读文献请下载原文：
Parhizkar S, Gent G, Chen Y, Rensing N, Gratuze M, Strout G, Sviben S,Tycksen E, Zhang Q, Gilmore PE, Sprung R, Malone J, Chen W, Remolina Serrano J, Bao X, Lee C, Wang C, Landsness E, Fitzpatrick J, Wong M, Townsend R, Colonna M, Schmidt RE, Holtzman DM. Sleep deprivation exacerbates microglial reactivity and Aβ deposition in a TREM2-dependent manner in mice. Sci Transl Med. 2023 Apr 26;15(693):eade6285.
编 译/ 刘颖璇
校 审/ 蔡玉洁
