NB：浙江大学孙丽团队报道脑内单突触连接的形态示踪和功能鉴定_

脑内单突触连接的形态示踪和功能鉴定

Morphological Tracing and Functional Identification of Monosynaptic Connections in the Brain: A Comprehensive Guide

李媛媛1,2,3 • 方圆媛1,2,3,4 • 孙丽1,2,3

1浙江大学医学院附属精神卫生中心/杭州市第七人民医院，脑科学与脑医学学院，杭州310058，中国

2浙江大学良渚实验室，教育部脑科学与脑机集成前沿科学中心，脑机智能国家重点实验室，杭州311121，中国

3浙江大学国家卫生健康委与中国科学院医学神经生物学重点实验室，杭州310058，中国

4中国医学科学院基础医学研究所-北京协和医学院基础学院，北京 100005，中国

第一作者：李媛媛、方圆媛

通讯作者：孙丽

光遗传学、神经元分型和标记以及环路追踪近年来的发展推动了中枢神经环路的解剖研究。识别特定神经元上下游的单突触连接是理解复杂神经环路和研究行为机制的基础之一。然而，实际实施单突触连接追踪技术和功能鉴定，特别是对于缺乏经验的研究人员而言，仍然具有挑战性。这些方法的不当应用和对结果的错误解释会阻碍实验的进展并导致错误的结论。

在本文中，研究人员基于现有文献报道和自己实验室的实际应用经验，利用病毒示踪技术对单突触连接的形态鉴定进行了全面描述，并通过光遗传学结合电生理记录和药理学方法详细阐述了单突触连接的功能鉴定（图1）。

图1 通过光遗传学结合电生理学和药理学对单突触连接进行功能鉴定的图示。光遗传学刺激（蓝光，473 nm）表达ChR2的神经元（绿色）轴突末梢下游目标区域会诱发“全或无”的动作电位（1），导致显著的去极化（2，黑色电位线），激活末梢的电压门控钙通道并触发突触囊泡释放，在单突触连接的神经元中产生突触后电位（3，黑色电位线）。动作电位沿轴突逆向传播（4），并通过轴突侧支传播，触发中间神经元（黑色）的兴奋，诱导动作电位驱动的末梢去极化（5，黑色电位线）和多突触连接神经元（黄色）中的突触后电位（6，黑色电位线）。应用钠通道阻滞剂TTX可以阻断光遗传学刺激诱导的动作电位的产生和传播，从而阻断单突触（2和3，红色电位线）和多突触连接神经元（5和6，红色电位线）动作电位驱动的末梢去极化和的突触后电位。尽管光遗传学刺激可以诱导表达ChR2的神经元末梢发生小幅度去极化（2，红色电位线），但这种去极化不足以诱导电压门控钙通道激活和突触囊泡释放。钾通道阻断剂4-AP的应用增加了膜去极化、膜电阻和Ca2+通道激活，放大了光遗传学诱导的Ca2+流入（2，蓝色电位线），从而诱导单突触连接神经元的突触后电位（3，蓝色电位线）。然而，在多突触连接的神经元中，由于缺乏直接光诱导的神经末梢去极化，无法记录到突触后电位（6，蓝色电位线）。药理学方法可以帮助进一步识别参与突触传递的神经递质类型，主要涉及兴奋性谷氨酸能突触和抑制性GABA能突触（3，黄色电位线）。

同时，研究人员也对单突触连接的形态鉴定与功能鉴定中所涉及到的基本原则、具体操作细节和关键步骤进行了细致的阐述，并强调了实验过程中的技术考虑和潜在问题，旨在为研究人员提供实用性指导。

关键词：跨单突触；逆行；顺行；病毒工具；神经环路；光遗传学；电生理学