导读：
神经胶质细胞间的通讯对阿尔茨海默病（AD）的病理生理学有着深远的影响，但其潜在机制尚不清楚。近期Nature Neuroscience杂志上发表了题为“Regulation of cell distancing in peri-plaque glial nets by Plexin-B1 affects glial activation and amyloid compaction in Alzheimer's disease”的研究论文,在这里揭示了反应性星形胶质细胞在淀粉样蛋白斑块周围的胶质细胞网中控制细胞间距的作用，这限制了小胶质细胞对Aβ的覆盖，这是检测和吞噬淀粉样蛋白沉积的先决条件。这一过程是通过引导受体Plexin-B1介导的，Plexin-B1是迟发性AD的关键网络调节因子，其在斑块相关星形胶质细胞中以冠状模式显著上调，其表达水平与AD患者的斑块负荷和疾病严重程度相关。在APP/PS1小鼠中，Plexin-B1ques缺失导致斑块周围神经胶质网变小，细胞间距减少，Aβ斑块的神经胶质覆盖增强，以及反应性星形胶质细胞和疾病相关小神经胶质细胞的转录变化，这些变化与神经胶质活化和淀粉样蛋白清除有关。此外，淀粉样斑块负荷降低，同时向致密核心斑块转变，减少神经炎性营养不良。总的来说，Plexin-B1通过增加细胞间距来控制神经胶质网络结构，导致Aβ的胶质细胞覆盖不良，淀粉样蛋白清除和压实减少。因此，通过靶向引导受体来调节神经胶质间距，改善其与Aβ斑块的相互作用，为减轻AD中神经炎症提供一种新的替代治疗策略。
结果一：Plexin-B1是一种关键的网络调节因子，其表达与斑块负荷相关
为了揭示AD病理生理学基础的新分子参与者，作者研究团队对来自西奈山脑库队列中的人类健康对照和AD患者的转录组和基因组数据进行了多尺度基因网络分析。作者团队鉴定了Plexin-B1（基因符号PLXNB1）作为晚发型AD潜在的共调节子网络中的枢纽基因（图1A）。基因富集分析显示，PLXNB1为中心的网络显著富集星形胶质细胞特异性基因和AD中上调的基因（图1B），支持Plexin-B1在调节AD中星形胶质细胞反应性的潜在作用。一致地，来自人和小鼠脑的独立细胞类型特异性RNA-seq数据证实PLXNB1主要在星形胶质细胞中表达。富集分析还表明，PLXNB 1网络基因显著富集了基因本体（GO）术语“调节小GT受体介导的信号转导”（图1B），这与通过Ras/Rap控制细胞骨架和细胞粘附动力学的Plexin信号传导一致。来自AD患者中两个高度受累区域的上级颞回和海马旁回的转录组学数据表明PLXNB 1表达水平与淀粉样斑块负荷呈正相关（图1C）。
图1 Plexin-B1上调与斑块相关，并与人类AD患者的疾病严重程度相关结果二：神经胶质网斑块相关星形胶质细胞中Plexin-B1表达上调
为了定位Plexin-B1蛋白的表达，作者研究团队进行了免疫组化（IHC）的AD患者的死后脑标本的免疫组化（IHC）。引人注目的是，检测到Plexin-B1的冠状表达模式，使人想起AD脑中斑块周围的反应性神经胶质网（图1D）。在没有淀粉样斑块的皮质区域中，Plexin-B1的基线表达较低。免疫共染色显示神经胶质网中Plexin-B1和GFAP的重叠，与PLXNB 1主要在星形胶质细胞中表达的转录组学数据一致。作者团队将IHC分析扩展到跨越疾病严重程度谱的11名患者的群组，包括3名没有临床症状的个体，并且检测到Plexin-B1表达评分与淀粉样斑块、神经纤维缠结和神经炎斑块的神经病理学ABC评分呈正相关性（图1E）。
结果三：PLXNB1在与Aβ通路相关的AD分子亚型中诱导最强
作者研究团队最近对人类AD脑的转录组学分析揭示了五种分子亚型，包括典型（C1，C2）、中间（B1，B2）和非典型（A），其特征在于失调途径的不同组合。作者团队检查了5种AD分子亚型中的PLXNB 1表达，发现PLXNB 1在典型的AD亚型C1和C2中上调最高（图1F），这与Aβ相关通路的激活密切相关。总之，作者团队的转录组学和组织学分析集中在Plexin-B1在星形胶质细胞反应性中的潜在作用，以响应AD脑中淀粉样蛋白的形成。
结果四：Plexin-B1控制胶质网中斑块相关星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞间距
为了理解Plexin-B1在AD病理生理学中的功能，该研究团队培育Plxnb1敲除（PB1-KO）等位基因植入APP/PS1转基因小鼠中，这是AD的淀粉样蛋白生成小鼠模型。由于针对小鼠Plexin-B1的特异性抗体对于作者研究团队来说不可以用于IHC（已经测试了四种商业抗体，没有一种显示出特异性），利用PB1-KO等位基因中包含的lacZ报告基因来监测Plxnb1表达。来自6月龄APP/PS1Plxnb1+/-小鼠的脑切片的XGal染色显示LacZ/Plxnb1的显著上调，其局限于斑块周围区域，而在没有斑块的皮质区域中，表达水平低。因此，Plexin-B1在人和小鼠AD脑中的斑块周围神经胶质网中强烈上调。
作者研究团队接下来检查了Plexin-B1缺失对淀粉样斑块周围星形胶质细胞反应性的影响。该团队观察到APP/PS1 PB1-KO小鼠与APP/PS1同窝小鼠相比，星形胶质细胞动员和神经胶质细胞网络结构存在显著差异。具体来说，在6个月大的APP/PS1小鼠的皮质中，淀粉样蛋白斑块被许多反应性星形胶质细胞GFAPhigh包围，它们共同形成环状胶质细胞网，从斑块延伸约两个细胞层宽。相比之下，在年龄和皮质面积匹配的APP/PS1 PB1-KO小鼠中，斑块周围存在显著减少的反应性星形胶质细胞数量（减少超过50%），形成仅约一个细胞层深的胶质细胞网（图2A-C）。此外，在PB1-KO中斑块相关星形胶质细胞的细胞间距似乎减少，神经胶质细胞聚集在较小的神经胶质网中，星形胶质细胞过程朝向斑块极化，并显示出与淀粉样物质的更多接触和更高的斑块覆盖率（图2B,C）。这些表型表明Plexin-B1的功能是加强神经胶质网中的细胞距离，导致更大但更松散的斑块周围神经胶质网;Plexin-B1缺失导致更小但更紧凑的神经胶质网，具有更高的斑块覆盖率。
由于淀粉样蛋白斑块周围的神经胶质网由反应性星形胶质细胞和活化的小胶质细胞组成，作者团队想知道PB1-KO中斑块相关星形胶质细胞的募集和细胞间距的变化是否也可能影响反应性胶质细胞网中的小胶质细胞组织。事实上，在活化的小胶质细胞中上调的标志物Iba1的IHC显示，APP/PS1 PB1-KO小鼠中斑块附近的Iba1+小胶质细胞比APP/PS1同窝出生的小鼠少得多（图2B,D）。对于反应性星形胶质细胞，PB1 KO中斑块相关小胶质细胞的细胞间距也减少，表现为胶质细胞网中小胶质细胞密度增加和小胶质细胞突起的淀粉样蛋白覆盖率较高（图2D）。因此，反应性星形胶质细胞中的Plexin-B1诱导不仅对星形胶质细胞产生细胞自主作用，而且影响小胶质细胞动员和进入Aβ沉积物。
在不存在AD病理学的情况下，单独的Plexin-B1 KO似乎不影响稳态星形胶质细胞和小胶质细胞群体，因为在PB1-KO和野生型（WT）基因型之间皮质中的GFAP或Iba1表达相当。同样，在APP/PS1背景中，在远离斑块的皮质区域中，Plexin-B1缺失也没有引起GFAP+或Iba1+细胞的密度或形态的明显变化。总之，这些观察结果表明Plexin-B1缺失主要影响斑块相关神经胶质细胞响应AD病理的反应性（图2E）。
图2 在小鼠AD模型中，Plexin-B1 K导致更小但更紧凑的斑块周围神经胶质网
结果五：Plexin-B1缺失导致与淀粉样蛋白清除的胶质功能相关的转录变化
为了获得Plexin-B1 KO对受AD影响的大脑中基因表达变化的影响，研究团队对来自3-4月龄的有或没有PB1-KO的APP/PS1小鼠的前额皮质组织进行RNA测序（RNA-seq），这是Aβ淀粉样蛋白活跃沉积但斑块尚未完全发育的时间段。该团队鉴定了APP/PS1 PB1-KO和APP/PS1样品之间的2723个差异表达基因（DEGs，P
为了剖析AD脑中依赖Plexin-B1的细胞类型特异性基因表达变化，作者团队使用10X Genomics平台对来自6月龄时具有或不具有Plexin-B1 KO的APP/PS1小鼠的前额皮质组织进行单细胞（sc）RNA-seq测序。在应用质量控制过滤器后，从来自四种基因型：WT、PB1-KO、APP/PS1、APP/PS1PB1-KO 的总共27286个细胞获得数据，基于标志物基因表达将其划分为10个不同的细胞簇（图3A）。小胶质细胞占据了最大的簇（43%），其次是内皮细胞（22.6%），星形胶质细胞（16.6%）和其他细胞类型，份额较小，即成纤维细胞/平滑肌细胞、巨噬细胞、少突胶质细胞、神经元、周细胞和室管膜细胞。scRNA-seq数据证实，Plxnbl表达主要限于星形胶质细胞簇，并且其在PB 1-KO基因型中被有效消除（图3B）。
星形胶质细胞的进一步亚聚类分析鉴定了具有离散转录状态的四个亚簇（sc-0至sc-3）（图3C）。亚群sc-0代表具有间隙连接组装基因的高表达，但与趋化因子结合相关的基因的低表达的稳态星形胶质细胞。Sc-1显示出与反应性星形胶质细胞最强的关联，这是基于对A1型反应性星形胶质细胞定义的基因标记的高得分（图3D）。值得注意的是，A2型和泛反应性（由A1和A2反应性星形胶质细胞共享）基因特征也在sc-1星形胶质细胞中富集，尽管评分较低。事实上，波形蛋白，一种中间丝基因和泛反应性星形胶质细胞的标志物，在sc-1星形胶质细胞中高度表达。有趣的是，Tyrobp和Trem2，疾病相关小胶质细胞（DAM）的两种众所周知的标志物，但在AD条件下的星形胶质细胞中也上调，也在sc-1星形胶质细胞中强烈上调（图3E）。小得多的sc-2专门用于脂质代谢，而sc-3可能代表具有高表达的Gfap和Tyrobp以及参与吞噬作用的基因的小的过渡群体。在所有星形胶质细胞亚群中检测到Plxnb1 mRNA，但sc-3具有最高的Plxnb1表达（图3E）。
当比较不同基因型条件下的星形胶质细胞亚群时，作者团队观察到以下特征（图3F）：首先，sc-1反应性星形胶质细胞在APP/PS1中相对于WT极大地扩增（57%vs.12%），并且相应地，sc-0稳态星形胶质细胞与WT相比在APP/PS1中显示收缩（38%vs.78%），sc-2星形胶质细胞也是如此（2%vs.6%）。其次，PB1-KO导致APP/PS1背景中四种星形胶质细胞亚群的代表性发生显著变化，与APP/PS1中的57%相比，APP/PS1 PB1-KO中的sc-1反应性星形胶质细胞减少至23%，而sc-0稳态星形胶质细胞（66%）和sc-2星形胶质细胞（6%）的份额也恢复至更接近WT中的水平。这与作者团队的IF数据一致，显示APP/PS1 PB1-KO与APP/PS1相比较，脑中斑块周围具有较少反应性星形胶质细胞的较小神经胶质细胞网。第三，与WT（12%）相比，没有AD转基因背景的单独的PB1-KO导致sc-1反应性星形胶质细胞的小扩增（22%）。总之，在单细胞水平上的转录组学数据提供了分子证据，支持丛蛋白-B1消融对星形胶质细胞响应淀粉样斑块的反应性的影响。
除了减少反应性星形胶质细胞的比例外，Plexin-B1缺失还影响反应性星形胶质细胞的基因表达谱。作者团队在APP/PS1 PB1-KO和APP/PS1之间的sc-1反应性星形胶质细胞中鉴定了541个DEGs（>1.25倍变化，P图3G）。值得注意的是，Apoe是一种脂质代谢基因和AD的风险因素，是PB1-KO导致的sc-1反应性星形胶质细胞中上调最多的基因之一。作者团队通过ELISA测量培养的原代星形胶质细胞的ApoE蛋白分泌证实了这一发现，其显示在基线条件下PB1-KO星形胶质细胞的ApoE分泌显著高于WT对应物。用Aβ刺激增强WT星形胶质细胞的ApoE分泌，但没有进一步增强PB1-KO星形胶质细胞已经高水平的ApoE分泌。
为了进一步支持在Plexin-B1 KO条件下反应性星形胶质细胞关于淀粉样蛋白代谢的改善的功能状态，基因本体分析显示在APP/PS1 PB1-KO和APP/PS1之间sc-1反应性星形胶质细胞中上调的DEGs显著富集与淀粉样蛋白β形成的负调控相关的基因，包括Apoe、Clu、Ntrk2（BDNF的受体）、Prnp和Rtn3（reticulon-3，其参与β-分泌酶1（BACE1）的调节，β-分泌酶1是一种跨膜蛋白酶，催化从淀粉样前体蛋白形成Aβ肽的第一步）（图3H）。Plexin-B1缺乏还引起与细胞代谢相关的基因的上调，例如，L天冬氨酸跨膜转运（Slc1a2、Slc1a3）、谷氨酸催化剂（Glud1、Glu1）和细胞色素氧化酶活性（Cox8a、Cox4l1、Ndufa4）（图3H）。此外，脂质途径基因在Plexin-B1缺陷的sc-1反应性星形胶质细胞中也显著上调，例如，花生四烯酸-CoA连接酶活性（Acsl6，Acsl3），参与星形胶质细胞投射的基因（Aqp4，Slc1a2，Atplb2）也是如此，与APP/PS1 PB1-KO小鼠中观察到的形态学和细胞距离表型一致（图3H）。最后，Plexin-B1 KO还诱导与钙依赖性磷脂酶A2活性（Pla2g7，Prdx6）和长期突触增强的负调节（Fam107a，Ptn）相关的基因（图3H）。
在APP/PS1背景下，PB1-KO sc-1反应性星形胶质细胞中下调的基因在细胞连接解体（C1qa/B/c，Cx3cr1）、神经胶质细胞迁移调节（P2ry12）和细胞-基质相互作用（Itga1）的GO术语中显著富集，与AD相关神经胶质网中星形胶质细胞组织改变的表型一致（图3H）。此外，GO分析支持PB1-KO导致炎症环境减弱，因为与补体激活（C1qa/B/c）和TNF超家族细胞因子产生（Cx3cr1，FoxP1）相关的基因受到抑制。此外，Cxcl12（也称为SDF-1），一种显示诱导星形胶质细胞增殖的趋化因子，是通过PB1-KO下调最多的基因之一（图3G）。总的来说，作者研究团队的转录组学分析提供了进一步的证据，表明Plexin-B1缺失改变了反应性星形胶质细胞的功能状态，与改善的淀粉样蛋白β斑块清除和减少的神经炎症一致。
图3 scRNA-seq揭示了Plexin-B1缺失对AD脑中反应性星形胶质细胞活化状态的影响结果六：Plexin-B1缺失也改变了疾病相关小胶质细胞的转录状态
作者团队接下来研究了小胶质细胞的scRNA-seq数据，其可以被划分为11个不同的亚群（图4A）。由于疾病相关的小胶质细胞（DAM）已被鉴定为与AD相关的独特群体，因此调查了DAM标签基因（Lpl、Cst7、Axl、Itgax、Spp1、Cd9、Ccl6和Csf1）的表达，这些基因在sc-9中均显示出高表达（图4B），而与其他小胶质细胞亚群相比，稳态小胶质细胞基因（Cx3cr1、P2ry12、Tmem119）在sc-9中均下调（图4C）。因此，sc-9小胶质细胞是AD影响的大脑中DAM群体的代表。
DAM样sc-9小胶质细胞的比例受到APP/PS1背景中Plexin-B1 KO的影响（图4D）。首先，APP/PS1导致sc-9从WT中的1%大幅扩增至APP/PS1中的4%。第二，PB1-KO导致部分恢复，在APP/PS1 PB1-KO中sc-9降低至2%。第三，在不存在AD病理学的情况下，单独的Plexin-B1 KO不会引起sc-9表达的明显变化。这些发现支持AD脑中Plexin-B1缺失导致的神经炎症减轻。
尽管sc-9小胶质细胞的群体份额减少，但Plexin-B1缺失以一种意味着增强的小胶质细胞功能的方式改变了sc-9 DAM小胶质细胞的转录组学特征。与APP/PS1相比，在APP/PS1 PB1-KO中的sc-9小胶质细胞中鉴定了超过1，000个DEG，其中绝大多数被上调（图4E）。基因富集分析显示Plexin-B1缺失导致诱导与增强的小胶质细胞活化（Cx3cr1、C1qa、Grn、Ifngra、Aif1（编码Iba1）和Tnf）、细胞连接解体（C1qb、C1qa、C1qc、Cx3cr1）和宿主防御反应（Ubb、B2m、Tlr2）相关的基因（图4F）。此外，与II类MHC蛋白复合物结合（Cd81、Ywhae、Hsp90ab1）、化学引诱物和嘌呤能受体活性（Cx3cr1、Ccr12、Ccr5、P2ry12、Gpr34）以及内溶酶体腔（Ctss、Ctsb、Lgmn）相关的基因在Plexin-B1缺失的情况下在sc-9小胶质细胞中也显著上调（图4F）。
图4 scRNA-seq揭示APP PB1-KO小鼠中改变的小胶质细胞活化结果七：Plexin-B1缺失导致斑块数量减少，向致密核心型转变，神经毒性降低
到目前为止，IHC和scRNA-seq数据表明，Plexin-B1缺失不仅影响神经胶质细胞的网络结构，而且影响反应性星形胶质细胞和DAM细胞中的转录反应，从而影响淀粉样蛋白代谢和神经炎症。作者团队接下来研究了这些变化如何影响淀粉样蛋白β清除、斑块形成和相关的神经毒性。
淀粉样蛋白斑块的组织学检查显示，与年龄匹配的APP/PS1小鼠相比，6个月大的APP/PS1 PB 1-KO小鼠中的斑块数量显著减少（图5A）。值得注意的是，斑块的平均尺寸也看起来更小，减少接近50%（图5A）。尺寸谱分析证实，PB1-KO导致淀粉样蛋白斑块向更小的尺寸转变（图5C）。
作者团队通过使用抗Aβ抗体6E10（其标记大多数淀粉样蛋白斑块）和Thio-S染料（其染色淀粉样蛋白斑块的核心）进行共染色来进一步调查淀粉样蛋白斑块的组成（图5B）。共染色方法允许根据斑块的淀粉样蛋白压实类型对斑块进行分类（图5D）。在6个月的APP/PS1小鼠的皮质中发现接近50%的斑块是纤维型的，35%是混合型的，15%是致密核心型的，而在APP/PS1 PB1-KO小鼠中，组成相反，15%是纤维型的，35%是混合型的，50%是致密核心型的（图5D）。由于致密核心斑块形成是小胶质细胞有效吞噬斑块物质的结果，斑块的小胶质细胞覆盖增加和小胶质细胞功能增强可能是APP/PS1 PB1-KO基因型向致密核心型转变的原因。
图5 AD小鼠Plexin-B1缺失减少斑块负荷，并向密集核心型转变淀粉样斑块通常被营养不良神经元膜的晕圈包围。为了测量淀粉样蛋白斑块在不同基因型条件下的神经毒性，作者团队对LAMP1进行了IF，LAMP1是一种在营养不良性神经突中高度富集的自噬和内-溶酶体标志物。作者团队发现APP/PS1 PB1-KO与APP/PS1小鼠相比，APP/PS1小鼠皮质中LAMP1标记区域的数量减少了50%（图6A,B），这反映了PB1-KO的整体斑块负荷减少。在APP/PS1 PB1-KO小鼠中，斑块周围的LAMP1标记的晕圈的平均尺寸也减小，LAMP1标记的总面积也减小，这反映了LAMP 1标记的晕圈的数量和尺寸（图6B）。因此，我们在APP/PS1 PB1-KO小鼠中观察到的减少的神经炎性营养不良与致密核心斑块反映限制神经毒性可溶性Aβ寡聚体传播的巨噬细胞介导的限制机制的概念一致。
作者团队接下来评估了溶酶体标志物CD68的表达，其标记活性吞噬小胶质细胞。在APP/PS1 PB1-KO和APP/PS1小鼠中检测到相对于Aβ标记的斑块的CD68+面积的可比比率（图6C），表明小胶质细胞的吞噬活性没有扩大，而是局限于PB1-KO中较小的足迹
图5 Plexin-B1 KO AD小鼠中的神经炎性营养不良减少结果八：在AD的Tau病变模型中，Plexin-B1缺失导致胶质增生减少
为了研究Plexin-B1在tau驱动的神经变性中的星形胶质细胞活化中的功能，作者团队通过交叉TAU-PS19系将该团队的研究扩展到tau病变的小鼠模型与Plexin-B1 KO等位基因。对3月龄TAU PB 1-KO小鼠的海马和内嗅皮质切片的IF检查显示Plexin-B1缺失导致在具有磷酸化-Tau的高积累的区域中的减弱的星形胶质细胞增多（图S9A）。还在这些区域中观察到减弱的小胶质细胞增生，表明神经变性区域中的炎性环境减少（图S9B）。类似地，与TAU小鼠相比，5月龄组的海马区的scRNA-seq证实了TAU PB1-KO中反应性星形胶质细胞群体（AstO）的缩小。因此，Plexin-B1在介导星形胶质细胞反应性中的作用不限于淀粉样蛋白驱动的AD，也适用于Tau驱动的神经变性。
图S9 Plexin-B1 KO减弱神经退行性变的TAU模型中的胶质增生
小 结
作者研究团队的数据证明了反应性星形胶质细胞通过导向受体Plexin-B1在斑块周围胶质细胞网中增加细胞距离的作用，导致Aβ聚集体的小胶质细胞覆盖受限，淀粉样蛋白压实减少，神经组织损伤扩大。抑制Plexin-B1的功能可能代表逆转这一过程的替代治疗方法，从而改善AD患者的疾病结局。
精选原文链接：
Huang Y, Wang M, Ni H, Zhang J, Li A, Hu B, Junqueira Alves C, Wahane S, Rios de Anda M, Ho L, Li Y, Kang S, Neff R, Kostic A, Buxbaum JD, Crary JF, Brennand KJ, Zhang B, Zou H, Friedel RH. Regulation of cell distancing in peri-plaque glial nets by Plexin-B1 affects glial activation and amyloid compaction in Alzheimer's disease. Nat Neurosci.2024 May 27. doi: 10.1038/s41593-024-01664-w.
https://doi.org/10.1038/s41593-024-01664-w
