小细胞外囊泡（sEVs）作为细胞间通讯的纳米载体，携带蛋白质与核酸，在疾病发展中起核心作用。其负载内容依细胞状态而异，反映出细胞特定的生理或病理情况。缺血性卒中是神经内科最常见的疾病之一。缺血缺氧环境下神经细胞活动代谢发生改变，释放的sEVs随之改变。其中非编码RNA，如环状RNA（CircRNA）丰度的改变是潜在的疾病标志物和治疗靶点。明确CircRNA在细胞内的分拣和转运机制具有重大的科学价值。RNA结合蛋白(RBP)是RNA转运的重要执行者，常被认为与sEVs转运RNA有关。此外，缺氧应激条件下RNA和RBP形成的蛋白质相分离产物—应激颗粒（SG）是细胞在不利环境下，储存重要遗传信息的临时避难所。与此同时，SG的解聚和降解过程与外泌体的包装过程共享了部分的胞内环节。然而，RBP和SG在缺氧相关CircRNA转运进入sEVs过程中，扮演了什么样的功能和角色目前仍不清楚。
暨南大学附属第一医院徐安定教授、逯丹副研究员课题组在前期工作中首次报道了来源于缺血半暗带神经元的环状RNA-CircOGDH在急性缺血性卒中潜在的诊疗价值，其可通过sEVs转移到患者外周血中1,2。伴随RNA结合蛋白FUS进入到神经元缺氧sEVs中，FUS是外泌体分泌RNA的必要条件3。
基于此，2024年6月26日，该团队联合中山大学麦鸿成副研究员在Advanced Science杂志上在线发表了题为：FUS selectively facilitates CircRNAs packing into neuronal small extracellular vesicles under hypoxia condition的研究论文，动态揭示了缺氧条件下RBP分子 FUS介导的缺氧相关细胞质CircRNA装载到sEV的转运机制，解析了FUS和SGs参与调控缺氧相关CircRNA的sEVs转运的分子机制，并强调了FUS Zf_RanBP结构域特异性识别和结合特异性CircRNA在上述机制中的重要意义。阐述了缺氧相关CircRNA在细胞内经过FUS以及SG逐步传递并包裹入sEVs的演变过程。
1. FUS蛋白经SGs向缺氧神经元
外泌体（HypEVs）转运
首先，该研究发现不同阶段HypEVs的表征与其装载的FUS丰度有高度一致的变化。活细胞工作站的结果则提示，缺氧可诱导FUS的出核，并在胞质中与外泌体的标记蛋白CD63共定位，但两者共定位染色点的尺寸要远远大于外泌体的大小。在进一步的探索中，作者发现FUS和CD63共定位的染色点与缺氧诱导生成的细胞应激颗粒有关。并且SG中的FUS丰度与外泌体中的FUS丰度呈现“此消彼长”的变化。这里提示了SGs可能参与了缺氧sEV的包装。
图1. 缺氧时FUS与HypEVs的表征和生成有关。2. 缺氧条件下FUS介导缺氧相关的CircRNAs
向SG募集，并最终向HypEVs转运
SGs是细胞应激时重要的RNA庇护场所，因此作者们进一步探究了FUS在SG中的定位，对SG募集胞质RNA的影响。他们利用一种基于化学点击的非特异性RNA标记方法，检测了在缺氧的不同阶段FUS与胞质非特异性RNA，SG标记蛋白G3BP1和外泌体标记蛋白CD63之间的共定位关系。结果显示，上述四者的胞内定位是高度统一的。而当敲除FUS时，则会导致缺氧细胞内应激颗粒数量的增加，但仅在一定程度上减少非特异性RNA在SG中的定位。基于此，作者进一步检测了FUS对缺氧相关的功能性环状RNA，CircOGDH胞内定位的影响。
首先，通过RIP-qPCR检测和EMSA检测，他们验证了FUS能够与CircOGDH发生相互作用。而RNA原位杂交和qPCR结果表明，敲除FUS后，CircOGDH不再向SG募集，并在胞质中蓄积。这说明，FUS介导了特异性的CircRNA在SG中的定位。为验证该作用是否具有普遍性，作者利用RICK-seq（newly transcribed RNA interactome using click chemistry sequencing）获取了新生的缺氧相关CircRNA的表达谱，并筛选出4个代表性的缺氧相关CircRNA。以CircMAP2为例，他们得出了与CircOGDH高度一致的结果。
图2.FUS介导了缺氧相关的CircRNA向SG募集此外，作者进一步论证了FUS介导特异性CircRNA向SG募集与CircRNA的外泌体转运过程之间的关系。他们通过调控SG生成和FUS的表达，观察了各种条件下外泌体表征的改变，以及其装载的特异性CircRNA丰度的变化。结果显示，抑制SG生成和敲除FUS均会大幅度减少外泌体中缺氧相关CircRNA的丰度，而敲除FUS的影响会更加显著。因此，作者得出了FUS经SG介导缺氧相关CircRNA向缺氧外泌体转运的分子机制。
图3. FUS和SGs共同参与调控缺氧相关CircRNA向HypEVs转运的过程3. FUS通过自身Zf_RanBP结构域选择性识别并
结合缺氧相关CircRNA，并介导其向HypEVs转运
为明确FUS特异性识别并结合缺氧相关CircRNA的分子策略，作者通过RNAfold、3dRNA以及ZDOCK等工具预测和构建了FUS与CircOGDH和CircMAP2互作形成的复合体的空间结构和可能的结合区域。通过构建包含有不同功能区域的FUS截短肽段，他们验证得出Zf_RanBP是FUS特异性识别CircRNAs接头序列（junction reads）的关键结构域。接着作者进通过构建删除了Zf_RanBP序列的突变FUS，进一步观察了FUS的Zf_RanBP结构域对其介导缺氧相关CircRNA向HypEVs转运的影响。
结果显示，相较于全长的FUS，突变FUS会导致缺氧相关CircRNA在胞质中蓄积，无法介导其向SG募集并向外泌体转运。此外，他们利用增强交联的免疫沉淀测序(eCLIP-seq)，进一步筛选了Zf_RanBP结构域特异性识别的RNA基序。因此，作者得出FUS可在缺氧条件下出核并在细胞胞质中的SG中凝聚；同时利用自身的Zf_RanBP结构域选择性识别并结合胞质中缺氧相关的CircRNA，一同向SG募集；当缺氧应激解除时，两者的复合体在SG解聚或降解后，被包装进入缺氧外泌体并最终向胞外转运。
图4. FUS通过自身Zf_RanBP结构域介导缺氧相关的CircRNA向外泌体转运的过程总结
该研究发现，缺氧条件下位于细胞核中的RBP 溶瘤融合蛋白（FUS）迁移出细胞核，被招募入细胞质的SG中。同时，胞质FUS基于其独特的结构域招募胞质功能性环状RNA加入SG。在缺氧应激消除后，SG逐渐降解，解散后的FUS及功能性环状RNA转运至sEV，从而发挥重要生理作用。并且明确了FUS结合circRNA的结构域Zf_RanBP及其功能。该研究的相关成果系统地论证了FUS在缺氧条件下将功能性细胞质环状RNA在装载到sEV的作用机制，揭示了sEV介导的circRNA转运机制并为细胞对缺氧的反应提供了见解。
图5. FUS介导的缺氧相关细胞质环状RNA在缺氧条件下装载到sEV的转运机制暨南大学附属第一医院为该研究的第一完成单位，臧建坤博士后（佛山市第一人民医院）、吴有盛博士后、苏璇琳博士、蔡凯微博士为本论文共同第一作者，逯丹副研究员、徐安定教授、麦鸿成副研究员（合作单位：中山大学孙逸仙纪念医院）为本论文通讯作者。
作者介绍
通讯作者：逯丹，副研究员，长期从事缺血性脑卒中的发病机制及治疗方面的研究，尤其擅长环状RNA、外泌体在急性缺血脑卒中的作用和机制研究等。以通讯作者/第一作者/共同第一作者发表SCI文章20余篇，近期代表性成果表在本专业领域的顶刊Circulation Research（IF=23.213）、Advanced Science（IF=14.3）、Bioactive Materials（IF=18）、 STROKE等国际权威杂志。授权的相关研究成果专利7项。主持国家级课题2项，省部级项目5项。广东省卫健委特支计划青年拔尖人才（2024公示），广州市科协青年科技人才托举项目（2023）。
共同通讯作者：徐安定，暨南大学临床神经科学研究所所长（二级教授、主任医师），广州市泛血管病基础及转化研究重点实验室主任，历任暨南大学附属第一医院神经内科主任、副院长、院长（曾）等职。第一完成人广东省科学技术奖二等奖1项、第二完成人广西省科学技术奖二等奖1项以及广东省医院协会医院管理与科技创新奖(科技类)一等奖1项。中国卒中学会“中国卒中奖”、广东省科教文卫工会“徐安定劳模和工匠人才创新工作室”、中国医院协会优秀医院院长、广东省医学领军人才。在Circulation Research（IF=23.213）、Advanced Science（IF=14.3）、Bioactive Materials（IF=18）、 Molecular Therapy（IF=12.1）、STROKE等国际权威杂志发表论文80余篇。近十年负责国家自然科学基金及其他省部级各类基金等项目30余项。主编、副主编、参编专著6部，参编本科教材2部。
共同通讯作者：麦鸿成，副研究员，博士生导师，中山大学“百人计划”中青年杰出人才，目前致力于急性脑损伤跨器官水平的组织光透明标记与成像技术的研发和应用。VIEW期刊(IF 9.7)青年编委会的成员。曾在 Nature Biotechnology、Nature Protocols 和 Stroke 等刊物上以第一作者的身份发表文章，在 Bioactive materials 、Advanced Science上以共同通讯作者的身份发表文章，同时受邀在 Nature Reviews Cancer 上发表短评。
第一作者：臧健坤，医学博士，毕业于暨南大学，在站博后（佛山市第一人民医院）。致力于外泌体在脑血管病发病机制方面的探索。主持省部级课题2项，以第一作者/共同第一作者发表SCI论文7篇。
第一作者：吴有盛，医学博士，在站博后，毕业于暨南大学。致力于脑血管相关神经元外泌体精准诊疗的研发和应用。主持省部级课题2项，以第一作者/共同第一作者发表SCI论文4篇。
第一作者：苏璇琳，医学博士，毕业于暨南大学。以第一作者/共同第一作者发表SCI论文3篇。主要从事脑血管方向研究。
第一作者：蔡凯微，医学博士，毕业于暨南大学。以第一作者/共同第一作者发表SCI论文2篇。主要从事脑血管病研究。
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202404822
参考文献
(1) Liu, Y., Li, Y., Zang, J., et al. Tsang, C. K., Xu, A., & Lu, D. (2022). CircOGDH Is a Penumbra Biomarker and Therapeutic Target in Acute Ischemic Stroke. Circulation research, 130(6), 907–924.
(2) Penumbra-targeted CircOGDH siRNA-loaded nanoparticles alleviate neuronal apoptosis in focal brain ischaemia. Liu Y, Zhang T, Zou X, Yuan Z, Li Y, Zang J, He N, He L, Xu A, Lu D. Stroke Vasc Neurol. 2024 Apr 30;9(2):134-144.
(3）Wu, Y., Huang, X., Tan, Z., et al. Mai, H., Xu, A., & Lu, D. (2023). FUS-mediated HypEVs: Neuroprotective effects against ischemic stroke. Bioactive materials, 29, 196–213.
(4) Jiankun Zang, Yousheng Wu, Xuanlin Su, Kaiwei Cai, et al. Hongcheng Mai, Anding Xu & Dan Lu. (2024). FUS Selectively Facilitates circRNAs Packing into Small Extracellular Vesicles within Hypoxia Neuron. Advanced Science. 26:e2404822. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202404822
