出生后TET活性缺失导致突触相关基因表达异常和认知功能损伤
Loss of TET Activity in the Postnatal Mouse Brain Perturbs Synaptic Gene Expression and Impairs Cognitive Function
刘霁纬1 • 张泽强2 • 朱志川3 • 李奎3,4 • 徐其武3,4 • 张静3 • 程学文3 • 李晗5 • 孙颖1 • 王继军5 • 胡璐璐6 • 熊志奇2,3,7 • 朱永川5
1上海交通大学医学院附属精神卫生中心，上海 200030，中国
2中国科学院大学，北京 100049，中国
3神经科学国家重点实验室，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，中国科学院，上海 200031，中国
4临港实验室，上海 201602，中国
5上海市重性精神病重点实验室，上海交通大学医学院附属精神卫生中心，上海 201108，中国
6复旦大学生物医学研究院，复旦大学附属肿瘤医院，上海市医学表观遗传学重点实验室，医学表观遗传与分子代谢国际科技合作基地（科技部）， 复旦大学上海医学院，上海 200032，中国
7上海脑科学与类脑研究中心，上海 201602，中国
第一作者：刘霁纬、张泽强
通讯作者：熊志奇、朱永川
5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是一种重要的DNA表观遗传学修饰，由5-甲基胞嘧啶（5mC）经双加氧酶（TET）家族蛋白催化而来，是胞嘧啶的羟甲基化形式。5hmC在脑中高度富集且主要存在于成熟神经元中，其丰度和分布对环境应激高度敏感且可逆。5hmC修饰异常与阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症、抑郁症、雷特综合征等神经系统疾病的发病有关。然而，5hmC修饰在脑（特别是在前脑兴奋性神经元）中的生理功能并不清楚，阻碍了5hmC做为相关神经系统疾病诊断标记物和干预靶点的开发。
本研究构建了条件性Tet三基因敲除（cTKO）小鼠，这些小鼠出生后其前脑兴奋性神经元中同时缺失Tet1、Tet2和Tet3基因。研究人员发现Tet基因敲除导致5hmC水平显著下降，但并未对大脑整体的解剖结构有明显的影响。在一系列运动、情绪和认知相关行为学测试评估中，cTKO小鼠表现出长期关联记忆和空间记忆的严重损伤。高尔基染色表明cTKO小鼠桶状皮层中锥体神经元树突棘长度更长，且电生理记录显示出生后30天的cTKO小鼠桶状皮层锥体神经元自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）幅度减小，提示cTKO小鼠存在突触形态和功能异常。进一步地，利用重亚硫酸盐和氧化重亚硫酸测序技术，研究人员获得了5hmC和5mC在整个基因组中的高分辨率图谱。这些数据显示，Tet基因敲除导致整个基因组水平5hmC和5mC修饰的改变：15947个基因存在低-羟甲基化区域（hypo-DHMR），14768个基因存在高-甲基化区域（hyper-DMR）。其中，12626个基因（约70%）既有hypo-DHMR也有hyper-DMR区域。结合转录组测序，共发现了167个既有hypo-DHMR也有hyper-DMR区域的差异表达基因。基因本体富集分析表明这些差异基因富集在树突棘细胞组分上，基因集富集分析显示cTKO小鼠与突触前组织相关的群体基因整体表达存在异常。
图1 cTKO小鼠认知损伤、突触功能异常。A 前脑兴奋性神经元中敲除Tet1、Tet2、Tet3基因后5hmC水平显著降低；B 基因组圈图显示DHMR和DMR在整个基因组中的分布；C 场景依赖的恐惧记忆检测中静止时间；D 线索依赖的恐惧记忆检测静止时间；E 巴恩斯迷宫训练阶段错误次数；F 巴恩斯迷宫训练阶段找到逃生洞口花费时间。G 巴恩斯迷宫训练阶段最后一天小鼠寻找逃生洞的策略；H 巴恩斯迷宫测试阶段每组平均热图；I 巴恩斯迷宫测试阶段目标象限停留比例；J 桶状皮层锥体神经元树突棘高尔基染色示意图；K 桶状皮层锥体神经元树突棘长度统计；L 桶状皮层锥体神经元mEPSC代表图。
图2 小鼠海马兴奋性神经元中敲除Tet1/2/3基因引起突触相关基因去甲基化和表达水平异常。A 差异表达基因（DEGs）与hypo-DHMR或hyper-DMR修饰基因的韦恩图；B DEGs与hypo-DHMR或hyper-DMR修饰基因的火山图；C 同时存在hypo-DHMR和hyper-DMR修饰的差异基因RNA-seq表达热图；D 基因本体（GO）分析同时存在hypo-DHMR和hyper-DMR修饰的差异基因富集的生物过程和细胞组分；E 同时存在hypo-DHMR和hyper-DMR修饰的差异基因富集的信号通路相互作用分析，基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析；F 基因集富集分析（GSEA）分析整个转录组特定基因集的表达情况；G RT-qPCR验证突触功能、学习记忆相关通路差异基因在cTKO海马中的异常表达。
综上所述，上述结果表明，5hmC修饰通过调控基因表达网络影响突触功能和学习记忆过程。这项研究进一步阐明了5hmC在前脑兴奋性神经元中的功能，对全面揭示表观遗传学在神经系统中的调控机制具有重要的意义。
关键词：5羟甲基胞嘧啶；TET；DNA去甲基化；突触；学习记忆；表观遗传学
