导读
骨髓细胞上表达的小胶质受体触发受体2 （TREM2）是阿尔茨海默病（AD）的主要危险因素。实验表明，Trem2缺乏影响实质淀粉样蛋白（Aβ）沉积。然而，TREM2在脑血管淀粉样变性，特别是脑淀粉样血管病（CAA）中的作用仍未被探索。近期，作者团队在《Alzheimer's & Dementia》杂志发表题为“Loss of TREM2 diminishes CAA despite an overall increase of amyloid load in Tg-SwDI mice”的研究论文，研究团队将caa易感AD模型Tg-SwDI （SwDI）小鼠与Trem2敲除小鼠杂交，产生SwDI/TWT、SwDI/THet和SwDI/TKO小鼠，并在16月龄时进行病理和生化分析。结果发现Trem2的缺失导致CAA和小胶质细胞关联的急剧下降，尽管总体脑a β负荷显著增加。单核RNA测序分析显示，在Trem2缺失的情况下，小胶质细胞被激活，但被困在向完全反应状态过渡的过程中，与血管细胞的反应不同。作者团队提供了TREM2差异调节实质和血管A β病理的第一个证据，为AD的TREM2和Aβ靶向治疗提供了重要意义。
结果一：Trem2的缺失加剧了淀粉样蛋白的沉积和产生
在一组按性别和基因型匹配的16月龄SwDI/Trem2小鼠中，评估了Trem2缺乏对淀粉样蛋白病理的影响。免疫组织化学（IHC）分析显示，与SwDI/TWT小鼠相比，SwDI/TKO小鼠的皮层（图1A- b）、海马（图1A， C）和丘脑（图1D-E）中6E10免疫反应性测量的淀粉样蛋白沉积明显加重。6E10免疫反应区定量显示，与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO中所有三个定量区域的淀粉样蛋白负荷增加了约2倍（图1F-H）。对斑块大小分布的亚分析显示，斑块在皮层图像中被分为小（ 40 μm），差异相同（图S1A-C）。值得注意的是，SwDI/TWT和SwDI/THet小鼠之间没有显著差异，这表明Trem2的一个拷贝足以阻止淀粉样蛋白病理。
图1. Trem2缺失加剧了SwDI小鼠的总淀粉样蛋白沉积
为了研究淀粉样蛋白沉积增加的潜在原因，我们进行了Aβ40-和a β42特异性定量ELISA。在SwDI小鼠中，在荷兰和爱荷华家族AD突变的驱动下，Aβ40在脑实质和脑血管血管中的积累比Aβ42更具攻击性因此，Aβ40和Aβ42在碳酸盐可溶性和不溶性（胍不溶性）馏分中被评价。正如预期的那样，与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO小鼠的Aβ40、Aβ42和Aβ40/Aβ42比值在碳酸盐可溶性和不溶性组分中均显著增加（图2A-D）。此外，与免疫染色结果一致（图1），SwDI/TWT和SwDI/THet小鼠之间无显著差异（图2A-D）。因此，随后的分析集中在SwDI/TWT组和SwDI/TKO组之间的比较。免疫印迹分析显示，与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO组BACE1水平显著升高（图2E-F），提示APP淀粉样变性加工的增强导致了SwDI/TKO小鼠中a β40和a β42水平的升高。
图2 Trem2缺失可提高SwDI小鼠的总体Aβ水平，并诱导APP加工
结果二：Trem2缺失减少了CAA，尽管总纤维aβ增加
在缺乏Trem2的情况下，a β40/ a β42比值升高（图2D）表明CAA可能增加。为了量化CAA，用甲氧基X04 （X04）染色原纤维Aβ，与CD31共染色，标记血管内皮，以帮助CAA可视化。结果显示，在皮质区域，尽管6E10+免疫染色丰富（图1），但SwDI/TWT小鼠的x04染色淀粉样蛋白原纤维/致密斑块很少（图3A-B），证实了早期报道的SwDI小鼠的实质淀粉样蛋白沉积是弥漫性的，这是由高水平的促血管Aβ40引起的。同样的研究还报道了CAA主要存在于丘脑和丘下，尽管与SwDI/TWT小鼠相比，其X04+斑块负荷最小（图3A-B， F）。相反，SwDI/TKO小鼠的皮质、海马和丘脑中总X04+淀粉样蛋白原纤维显著增加（图3A-E，图2a - bin支持信息），与6e10免疫染色的总淀粉样蛋白沉积增加相对应（图1）。在CAA最丰富的Trem2缺陷小鼠的丘脑中，CAA明显减少（图3F-G），这表明尽管a - β40/ a - β42增加或总a β增加（图2），但Trem2的缺失导致SwDI小鼠的CAA减少。为了证实这一意想不到的发现，我们对SwDI/TKO和SwDI/TWT幼崽的整个大脑半球进行了大脑清理，以进行3D成像。通过SHIELD、SmartClear、免疫染色程序对大脑进行处理，标记β斑块、小胶质细胞（IBA1）和血管（CD31），并使用SmartSPIM轴向扫描薄层显微镜成像。结果清楚地显示，与SwDI/ TWT相比，SwDI/TKO脑中的CAA显著减少，尽管SwDI/TKO的总a β负荷显著增加（图3H）。为了进一步了解当Trem2缺失时，纤维状淀粉样蛋白从CAA转变为弥漫性斑块后是否会发生致密性变化，我们分析了丘脑中每个个体X04+淀粉样蛋白染色的荧光强度。结果与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO小鼠的平均最大强度显著降低，平均最小强度显著增加（图S2C-D），表明Trem2缺乏降低了淀粉样蛋白原纤维的核心密度。
图3. 在SwDI小鼠中，尽管总淀粉样蛋白原纤维增加，但Trem2缺失降低了CAA
结果三：Trem2缺失减少了丘脑小胶质细胞增生，减少了CAA相关的小胶质细胞
TREM2在调节小胶质细胞的激活和功能中起着至关重要的作用，TREM2的缺失会改变小胶质细胞对a β的反应。为了评估Trem2缺失对SwDI小鼠小胶质瘤的影响，对脑切片进行IBA1免疫染色。有趣的是，IHC分析显示，与SwDI/TWT和SwDI/THet小鼠相比，SwDI/TKO小鼠的皮质或海马的整体小胶质细胞增生没有变化（图4A， D-E），尽管SwDI/TKO小鼠海马CA1定向层区域的小胶质细胞聚集明显减少（支持信息图S3A-B）。有趣的是，SwDI/TKO小鼠的丘脑小胶质瘤明显减少（图4B-C， F）。皮层均质液的免疫印迹分析也证实，在SwDI/TKO和SwDI/TWT小鼠之间，IBA1水平没有显著差异（图4G-H）。与a - β染色结果一致（图1），SwDI/TWT和SwDI/THet之间IBA1染色无显著差异。因此，在接下来的评估丘脑小胶质细胞病理的实验中没有包括SwDI/THet。
由于丘脑中的Aβ沉积主要是CAA，因此用X04和IBA1对脑切片进行共染色，以确定小胶质瘤的减少是否与该区域CAA的减少相对应。事实上，X04和IBA1在SwDI/TWT小鼠的丘脑中完全共定位（图4I），表明SwDI/TKO中小胶质细胞增生的区域特异性减少与CAA病理减少的位置相对应。与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO的丘脑中与caa相关的小胶质细胞显著减少（图4I-J），这与先前的文献显示在其他trem2缺陷转基因AD小鼠模型中斑块相关的小胶质细胞减少一致。此外，与SwDI/TWT小鼠相比，SwDI/TKO小鼠的小胶质细胞形态反应性较低，胞体较小，突起较长（图4K）。总之，这些数据表明TREM2的缺乏阻止了小胶质细胞的转换进入反应状态，并削弱小胶质细胞参与CAA的能力。
图4. Trem2缺失减少了丘脑中的小胶质细胞增生和CAA相关的小胶质细胞
结果四：Trem2缺失加重皮质和海马星形细胞增生
星形胶质细胞和小胶质细胞对淀粉样变有反应并调节神经炎症。为了评估Trem2缺乏对星形细胞形成的影响，我们对不同基因型小鼠的脑切片进行了GFAP免疫染色。结果显示，与SwDI/TWT小鼠相比，SwDI/TKO小鼠皮质和海马区星形细胞增生明显增加，而SwDI/THet小鼠未见变化（图5A-C， E-F），这与这些小鼠的总体Aβ沉积一致（图1）。通过对SwDI/TKO和SwDI/TWT小鼠皮质匀浆进行免疫印迹分析，证实了SwDI/TKO小鼠皮质中GFAP的显著增加（图5H-I）。
值得注意的是，GFAP免疫反应性与SwDI/TWT和SwDI/TKO在丘脑中（图5D， G），其中SwDI/TKO中CAA和小胶质细胞增生显著减少（图3和4）。这些结果表明星形胶质细胞激活与TREM2无关，并且对实质Aβ沉积的反应比CAA更大。
图5. Trem2缺失加重皮质和海马星形细胞增生
结果五：单核转录组学分析显示，在Trem2缺失的情况下，小胶质细胞被困在过渡状态
为了进一步研究Trem2缺失后病理变化的分子机制，我们对SwDI/TWT和SwDI/TKO小鼠额叶皮质组织进行了snrna测序。在去除低质量细胞核后，对36660个细胞核的转录数据进行二维无监督聚类t分布随机邻居嵌入（t-SNE）。为了避免手工标注细胞类型，我们应用自举算法将我们数据集中的细胞与已发表数据中的小鼠皮质细胞类型进行匹配，以预测细胞类型，即少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、血管细胞、少突胶质细胞（oligo）、抑制性神经元、兴奋性神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞（图6A-D）。将这些细胞类型产生的标记基因与报道的标记基因进行比较，以证实细胞类型预测（图6B-C）。对于这两种基因型，尽管在细胞类型的相对比例上存在一些个体差异，但总体而言，SwDI/TWT和SwDI/TKO在不同细胞类型的代表上没有显著差异（图6E-F）。
多项阿尔茨海默病研究使用了trem2缺陷模型，并在TREM2依赖的小胶质细胞中展示了不同的反应性转录组谱，其特征是存在于疾病相关小胶质细胞（DAM）中的基因。因此，分析首先集中在比较SwDI/TKO和SwDI/TWT的小胶质细胞簇上（图7A），鉴定出71个差异表达基因（DEGs），其中58个在SwDI/TKO中上调(图7B；支持信息表S2)。在deg中，已知的DAM基因，包括Ctsd、Ctsb、Gnas和APOE，在SwDI/TKO组中上调，而稳态小胶质细胞标记基因如Cx3cr1下调。值得注意的是，据报道，这些deg负责小胶质细胞从稳态阶段过渡到完全不依赖TREM2的1期DAM（也称为中间阶段）相应地，没有deg参与TREM2依赖性过渡到2期DAM（表S2）。对小胶质细胞的通路分析显示，与SwDI/TWT相比，SwDI/TKO中与小胶质细胞反应状态相关的通路明显上调，包括蛋白质合成、细胞死亡、能量产生、线粒体调节、免疫反应、自噬、脂质生物合成和代谢（图7C）。这些发现表明，缺乏Trem2的小胶质细胞在淀粉样变性反应中处于应激状态。然而，由于小胶质细胞在缺乏TREM2的情况下被困在DAM过渡的中间阶段，它们没有足够的反应性来包含Aβ沉积，导致SwDI/TKO小鼠淀粉样蛋白病理整体增加。
有趣的是，进一步重新聚类的小胶质细胞发现了两个亚簇(0和1；图7D-E)，尽管在SwDI/TWT和SwDI/TKO中，两个簇之间的小胶质细胞分布相似（支持资料中的图S4A）。通路分析表明，这两个小胶质细胞亚簇具有不同的功能。在小胶质细胞簇0中，蛋白质合成、线粒体功能和能量代谢是最显著富集的基因本体（GO）途径，而小胶质细胞簇1主要以免疫功能为特征，包括免疫细胞活化、吞噬和细胞因子产生（图S4B）。与SwDI/TWT相比，Trem2缺失增强了表征小胶质亚簇0和1各自的特征功能，表明小胶质亚簇0和1对SwDI/TKO应激小胶质状态的贡献不同（图7F）。
图6. SwDI/Trem2小鼠脑皮质样品的snRNA-seq分析区分了主要的脑细胞类型
结果六：在缺乏Trem2的情况下，血管周围巨噬细胞被差异激活
除了小胶质细胞外，TREM2也在巨噬细胞中表达为了了解SwDI小鼠淀粉样变背景下Trem2缺失对巨噬细胞的影响，我们对通过细胞类型预测鉴定的一小群巨噬细胞进行了进一步分析（图7G）。巨噬细胞被重新聚集成3个亚群(0、1和2；图7 h)。簇0覆盖的细胞比例最大，其特征是血管周围巨噬细胞（PVM）标记物CD163和Mrc1 (CD20652,53；图7 i)。pvm是一种独特的常驻脑巨噬细胞，其特征是与脑血管系统密切相关。在AD中，这些血管相关的巨噬细胞被证明会加剧AD病理，包括CAA和神经炎症，并有助于Aβ影响脑血流的有害作用。54,55 SwDI/TKO与SwDI/TWT相比，有两个显著的deg: Fkbp5，在AKT通路调节和NF-κB激活中至关重要，上调；而Malat1，一种非编码RNA，在携带功能失调的Trem2-R47H突变的小胶质细胞中被下调聚类0 （PVM）的通路分析显示，SwDI/TKO中蛋白质合成和免疫反应相关的通路更丰富（图7J）。此外，在缺乏Trem2的情况下，一些与细胞连接维持相关的通路上调（图7J）。Cluster 1巨噬细胞的特点是高表达经典MHC II类基因，如Cd74、H2-Eb1和H2-Ab1（图7I），表明免疫反应状态。虽然SwDI/TKO与SwDI/TWT相比没有发现明显的DEGs或通路，但SwDI/TKO中集群1巨噬细胞有增加的趋势（图S4C-D）。总之，这些发现表明，在缺乏TREM2的情况下，血管周围巨噬细胞被差异激活，可能导致SwDI/TKO小鼠的病理变化。
图7. Trem2缺失将小胶质细胞和血管周围巨噬细胞切换到反应性转录组谱
结果7.血管细胞类型分析揭示了壁细胞和星形胶质细胞对Trem2缺乏的不同反应
为了研究Trem2缺失对脑血管细胞的影响，我们进一步分析了snRNA-seq数据集，以鉴定血管细胞类型中的deg（图8A）。比较SwDI/TKO和SwDI/TWT小鼠，鉴定出6个上调和5个下调的蛋白编码deg(图8B；表S2)和通路分析表明它们在细胞骨架维持中起着至关重要的作用（图8C）。此外, 使用最近发表的亚型特异性血管标记基因，鉴定了59-61个不同的细胞簇，包括平滑肌细胞（SMCs）、血管轻脑膜细胞、周细胞、内皮细胞和星形胶质细胞（图8D-E）。SwDI/TKO与SwDI/TWT的通路分析揭示了血管细胞对Trem2缺失的不同反应。血管薄脑膜细胞和内皮细胞未见明显变化。SMC、周细胞和星形胶质细胞各自的重要通路如图8F所示。在SMC和周细胞中，SwDI/TKO的细胞活性总体增加，包括细胞骨架、细胞存活/发育和增殖以及免疫功能途径。此外，在SMC中，与平滑肌收缩相关的通路上调，而细胞外基质通路下调。由于微血管细胞外基质的增加与CAA相关，因此SwDI/TKO中细胞外基质的下调与CAA的降低是一致的。有趣的是，虽然在SMC和周细胞中发现的大多数重要通路上调，但在血管相关星形胶质细胞中几乎所有重要通路都上调在SwDI/TKO小鼠中下调。这些发现表明，不同类型的脑血管细胞对Trem2缺失表现出不同的反应，可能导致SwDI/TKO小鼠的病理表型。
图8.血管细胞类型分析揭示了壁细胞和星形胶质细胞对Trem2缺乏的不同反应
小结
本研究表明，尽管TREM2缺失会导致全脑淀粉样蛋白负荷的增加，但CAA的程度却有所下降。同时缺乏TREM2的小鼠模型显示出淀粉样蛋白在大脑其他区域的沉积增加，特别是在皮质和海马区域，这表明TREM2在淀粉样蛋白的清除方面可能发挥着关键作用。研究者推测，TREM2可能通过调节小胶质细胞的功能，影响淀粉样蛋白的清除机制，进而调控CAA的发生与发展。尽管TREM2的缺失可能导致整体淀粉样蛋白负荷的增加，但CAA的减少提示TREM2在不同类型的淀粉样蛋白沉积中可能具有不同的作用机制。总的来说，本文强调了TREM2在阿尔茨海默病不同病理表现中的复杂作用，尤其是在脑血管淀粉样变和淀粉样蛋白清除方面的不同影响。这项研究有助于深化我们对TREM2在神经退行性疾病中潜在治疗价值的理解。
精读论文请下载原文：
Zhong R, Xu Y, Williams JW, Li L. Loss of TREM2 diminishes CAA despite an overall increase of amyloid load in Tg-SwDI mice. Alzheimers Dement. 2024 Nov;20(11):7595-7612.
