生物系统和人工神经网路共同面对的一个重要问题是如何处理旧有记忆和新获取记忆间的干扰，这种不同记忆之间的干扰可能会导致“灾难性遗忘”（catastrophic forgetting）。关于大脑如何对记忆进行编码和巩固，一个重要的假说是两个阶段记忆形成假说【1】：第一阶段学习期间先有海马体编码记忆信息；第二阶段在非快速动眼睡眠（NREM）期间， 海马体产生尖波涟漪（sharp wave ripples）， 期间记忆会快速重演（memory replay；5-10倍速，50-200ms），从而巩固记忆以便转移至新皮层。但是，之前的研究表明，在NREM睡眠期间，只有大约10%的尖波涟漪拥有最新的记忆重演事件；更重要的是，海马体在尖波涟漪时会重演新的和旧的记忆，因而有造成干扰的可能。所以海马体究竟是如何在睡眠期间巩固新记忆，并同时不干扰旧的记忆呢？
图1：本研究假说（图片来源：唐文博，常宏宇，ayalab）2025年1月1日，来自康奈尔大学（Cornell University）的研究人员以长文形式在Nature杂志上发表了题为Sleep micro-structure organizes memory replay的论文（通讯作者是助理教授Azahara Oliva和Antonio Fernandez-Ruiz，共同一作为博士生常宏宇和博士后唐文博），发现了一种以瞳孔大小为介定标准的全新的睡眠结构，通过不同瞳孔大小来调节不同睡眠子状态下的记忆重演来帮助动物巩固新旧记忆。
Oliva认为：“我们的研究首次表明，通过观察动物的眼睛可以读取特定的睡眠记忆状态。”这些结果帮助我们更好的理解大脑是如何在不同的时间水平上来调节新旧记忆的巩固。
之前的假说认为，新旧记忆的回放是随机交叉发生在NREM睡眠期【2-4】（非快速眼动睡眠期；图1）。一直以来这类研究主要在啮齿动物进行，它们的NREM睡眠被认为只有一个同质的均一的阶段。但是，人类的NREM睡眠有不同阶段。所以可能存在有另外一种假说（图1），也即NREM睡眠其实具有一种此前未被识别的微结构， 这种结构广泛存在各种物种中，包括啮齿动物在内。这种时间上的微结构由不同子状态构成。其中的子状态具有专门的机制来支持近期的记忆巩固，而剩余的子状态用于保留先前的记忆。在人类和动物中，瞳孔大小波动已被证明是反映脑状态变化的敏感指标，因此或可表征这些子状态。为了验证这些假说，研究人员开发了结合电生理记录、闭环光遗传学和瞳孔测量技术(图2a)，用于监测自然睡眠情况下老鼠的脑状态，以揭示睡眠的时间组织结构及记忆重现的机制。
图2：瞳孔大小指示NREM睡眠存在子状态，其中小瞳孔记忆回放概率高a. 左图：自由活动小鼠的瞳孔计测和电生理实验方法。右图：通过DLC（DeepLabCut）和实时在线算法在不同脑状态下进行瞳孔跟踪。在底部显示了NREM期间瞳孔在峰值和谷值时的瞳孔状态。b. 瞳孔大小在不同睡眠阶段的变化轨迹。灰色区域突出了瞳孔大小在NREM期间的周期性振荡 （周期约为1分钟）。c. 新记忆回放概率和瞳孔大小（倒置显示）的关系。图片来源：Chang, Tang, et al. Nature
研究人员连续记录了两小时内小鼠睡眠状况，发现小鼠瞳孔大小在NREM状态下缓慢的扩大和缩小(图2b)，这种放大-缩小的瞳孔变化呈现周期性震荡，震荡周期约为1分钟（图2c）。然后研究人员统计了尖波涟漪回放近期记忆的概率(图2c)，并研究了此概率随瞳孔大小的变化关系。研究人员发现记忆回放的概率跟瞳孔大小呈显著的负相关(图2c)，即瞳孔缩小的状态下，记忆回放概率更高。
图3 瞳孔缩小的状态下干扰尖波涟漪影响近期记忆检索，但瞳孔放大的状态下的干扰不造成行为影响. a. 高密度电生理记录结合闭环光遗传学和瞳孔测量的实验方案。通过瞳孔追踪相机捕获的瞳孔图像输入到Raspberry Pi微控制器进行预处理，随后Raspberry Pi将数字脉冲发送到电生理记录的Intan 系统以实现同步。同时，通过闭环光遗传技术，如果瞳孔大小超过一定阈值并且在此期间检测到了SWR ，系统发出SWR干扰。b.小鼠路径在瞳孔缩小状态下（SWRpupilS；顶部）和瞳孔放大状态下（SWRpupilL；底部）干扰实验中的示例。黄色圆圈：在“奶酪板”迷宫种奖励的位置。实线：动物运动轨迹。c.小鼠路径在引入新奖赏位置的示例，蓝色圆圈：新奖赏位置，灰色方块，旧奖赏位置。d. 本研究总结。图片来源：常宏宇，唐文博，ayalab。
Azahara Oliva, Antonio Fernandez-Ruiz 和Buszaki课题组【5-7】之前发现如果在NREM期间利用光遗传学干扰所有的尖波涟漪，小鼠的记忆巩固会被干扰，而后小鼠的记忆检索行为会受损。利用此项技术结合瞳孔线上识别技术，研究人员开发了瞳孔大小介导的尖波涟漪闭环干扰系统（图3a）。小鼠先训练学习“奶酪板”任务：在一定数量的孔洞的板子上寻找和记住一个被放置糖水奖赏的孔洞位置。小鼠开始会花费较长时间找到奖赏，但是经数次后，小鼠会直接找到奖赏位置。让小鼠睡眠2小时期间，研究人员选择性地干扰了瞳孔缩小状态下的尖波涟漪，同时保留瞳孔放大时的尖波涟漪。之后，研究人员测试了小鼠的记忆检索的准确性（图3b上；找到原奖励位置的速度和精度）。未经干扰时，睡眠后的小鼠可直接找到奖赏位置，然而经过干扰的小鼠忘记了奖赏的位置。在控制组实验中，研究人员选择性干扰了瞳孔放大状态下的尖波涟漪，而保留了瞳孔缩小时的尖波涟漪。控制组小鼠的记忆表现没有影响（图3b下）。这组实验证明瞳孔缩小状态是巩固记忆的关键时期。但是这些记忆巩固的是只有新记忆还是新旧记忆都存在？于是研究人员在奶酪板任务中，先让老鼠学习一个奖励位置数天 （熟悉目标），之后再让老鼠学习一个新的奖赏位置，重复同样的瞳孔缩小状态下的尖波涟漪闭环干扰，之后测试小鼠对新旧位置的记忆，发现对瞳孔缩小状态下的尖波涟漪进行干扰只影响了新目标位置的记忆，而对旧目标位置没有影响（图3c）。这些结果从而证明了瞳孔缩小时代表的NREM睡眠子状态支持对近期记忆的回放。
通过分析睡眠中表征新旧记忆的细胞集群（cell assembly）的激活概率，研究人员发现了相应的支持证据：在瞳孔缩小状态下，与新记忆相关的、更具可塑性的细胞集群被激活得更多，而在瞳孔放大状态下，与旧记忆相关的、先前已经存在的细胞集群激活得更多；瞳孔放大-缩小代表的不同子状态和不同的环路特性相关：在瞳孔缩小状态下，存在更强的兴奋性输入；而在瞳孔放大状态下，存在更强的局部环路的抑制。
综上所述，该研究通过将瞳孔测量与小鼠的海马体大规模神经元记录结合，首次发现了NREM睡眠并非同质均一状态，而是具有一种特定的微结构；这种微结构含有不同的子状态，分别可以用来巩固不同的与新旧记忆（图3d），以避免记忆干扰。值得一提的是瞳孔测量作为一种非侵入性技术早已广泛用于人类认知的研究。因而，此研究通过瞳孔揭示的记忆结构可有助于优化用于帮助人类提升记忆的非侵入性干预实验，例如靶向记忆再激活。
