无论疾病的性质如何，以及无论希望对 DNA 序列进行何种修复，成功的基因组编辑都依赖于能否将编辑工具有效地输送到目标细胞和组织内。然而，利用当前的递送技术，如用于基因治疗的腺相关病毒（AAV）和慢病毒载体，以及脂质纳米粒子和其他非病毒载体，高效递送通常较大的编辑机制（如 CRISPR-Cas 组件）仍面临重大挑战。这些技术各有其缺陷，限制了它们在基因治疗中的广泛应用。因此，开发新的基因递送方法已成为当务之急。
2025年1月10日，北京脑科学与类脑研究所的孙文智团队与上海科技大学的胡霁团队在 Molecular Therapy 杂志上联合在线发表了一篇研究论文，题为“Efficient Gene Delivery Admitted by Small Metabolites Specifically Targeting Astrocytes in the Mouse Brain”。该论文介绍了一种创新的基因递送方法，称为 gDAM (gene Delivery approach Admitted by small Metabolites)，通过小代谢物实现以质粒 DNA 为载体的基因递送。研究团队开发的gDAM技术通过使用天然存在的小分子代谢物（如甘氨酸、L-脯氨酸和D-丙氨酸）实现了裸DNA的高效递送，并能在靶向星形胶质细胞中实现强而短暂的基因表达。与传统病毒载体相比，这种非病毒递送方式避免了免疫反应的风险，同时具备更大的基因负载能力。
1. gDAM技术优势（1）靶向星形胶质的精准基因递送
在研究中，将质粒和甘氨酸的混合物脑立体定位注射到Ai9转基因报告小鼠的中脑里，几天后小鼠大脑里会出现大量红色标记的细胞。通过免疫染色，可以确定这些被标记的细胞100%是星形胶质细胞。为了验证这种星形胶质细胞的特异性转染，我们首先将含有针对 Aldh1l1 基因的 EGFP-RPL10a 核糖体融合蛋白的 Aldh1l1::eGFP 小鼠与 Ai9 转基因小鼠杂交。然后，在甘氨酸的帮助下，将编码 Cre 重组酶的质粒载体注入双阳性后代的大脑。后续的成像结果显示，所有tdTomato标记的细胞也都是eGFP阳性细胞。
2. gDAM技术优势（2）能携带更大基因，实现一个质粒介导的基因编辑
与传统病毒载体相比，gDAM技术具有多项优势。传统病毒载体如腺相关病毒，因其包装容量有限（约4.7 kb）且存在免疫风险，使用受到限制。而gDAM技术不仅可以携带更大的基因负载，还能避免潜在的免疫排斥反应。研究者通过CRISPR/Cas9基因编辑工具展示了gDAM的优越基因负载能力。CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑工具，在科学和临床研究中得到了广泛应用。为实现基于CRISPR/Cas9的基因组编辑，研究者设计了一个约10 kb的大质粒载体，包含三个不连续的开放阅读框：CBh-Cas9、靶向eYFP基因的U6-sgRNA，以及用于表达Cas9的荧光报告基因CMV-mCherry。随机序列被用作非靶向对照。另一种表达Cre重组酶的质粒载体用于诱导eYFP在Ai3小鼠中脑星形胶质细胞中的表达。靶向sgRNA与Cas9蛋白结合，导致eYFP功能丧失，从而使星形胶质细胞中仅表达mCherry。相反，对照组中，mCherry和Cre重组酶诱导的eYFP在星形胶质细胞中共同表达。定量检测显示，sgYFP组中约89.8%转染了mCherry的星形胶质细胞没有eYFP表达，而对照组中有11.3%，表明CRISPR/Cas9成功诱导星形胶质细胞中eYFP基因的突变。测序结果显示，通过gDAM运输CRISPR/Cas9，在星形胶质细胞的eYFP基因目标位点成功诱导了移码嵌合。
3. gDAM技术优势（3）递送基因的表达时间可长可短
为了揭示 gDAM 的基因表达动力学特征，我们在 CMV 启动子控制下注射了表达 eGFP 的质粒 DNA，并在注射后第 3、5、10、15、20、25 和 30 天收集脑组织。结果显示，eGFP 表达在第 4 天达到峰值，并在第 10.5 天下降到最大荧光强度的一半，到第 25 天时，信号几乎消失。此外，注射后第 5、15 和 30 天时，单个星形胶质细胞中 eGFP 的荧光亮度与这一时间表达模式高度一致。同时，我们使用了在 GfaABC1D 启动子控制下表达 eGFP 的 AAV 载体。注射 AAV 载体后第 5 天，荧光强度非常微弱，但随后逐渐增强，直到第 30 天也未达到稳定状态。总之，这些结果表明，通过 gDAM 运送 DNA 质粒载体可以在星形胶质细胞内快速且短暂地表达外源基因。
要实现对遗传疾病的长期矫正，需要将治疗 DNA 有针对性地输送到特定细胞和组织，要实现对遗传疾病的长期矫正，需要将治疗用 DNA 精确输送至特定细胞和组织，并确保其在治疗剂量下稳定表达。PiggyBac（PB）转座子系统已被证明是实现体细胞整合的有效方法。在这项研究中，研究人员设计了一种包含 eGFP 的供体载体以及一种编码转座酶的辅助载体。随后，他们通过 gDAM 系统释放 PB，并在第 5 天和第 25 天测量荧光强度，观察到 eGFP 的荧光强度显著增加了 2.6 倍。eGFP 标记的星形胶质细胞显示出明亮的荧光，表明即使在六个月后，持续表达仍然可见。值得注意的是，在没有转座酶的情况下，六个月后无法检测到 eGFP 阳性细胞。此外，研究人员从注射部位的脑组织中提取了基因组 DNA，对 eGFP 基因进行 PCR 扩增，得到了预期大小的片段。相比之下，对照组（仅含 eGFP 质粒载体且不表达转座酶）未检测到任何 PCR 产物。这些数据表明，通过 gDAM 递送的 PB 成功将外源基因整合至星形胶质细胞的基因组，实现了长期表达。
4. 应用前景：从脑肿瘤到神经疾病
gDAM技术的一个重大亮点在于其在星形胶质细胞来源胶质瘤模型构建中的应用潜力。研究人员可以通过操控多种肿瘤相关基因的组合，研究不同基因突变对肿瘤发生的影响，从而为胶质母细胞瘤等恶性脑肿瘤的治疗靶点发现提供新思路。
此外，研究还表明，gDAM技术在免疫治疗中具有重要应用潜力。通过递送编码免疫刺激分子的基因，这种方法能增强肿瘤微环境中的免疫反应，为开发更有效的脑肿瘤治疗方案提供了可能。
总结与展望
总之，研究团队推出了一种突破性的基因递送系统——gDAM（通过小代谢物递送基因），这可能会彻底改变科学家和临床医生靶向大脑星形胶质细胞的方式。研究人员将裸DNA与多种小代谢物结合，包括甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-组氨酸、D-丙氨酸、甘-甘和甘-甘-甘。这种简单的组合使裸DNA能够有效且特异性地递送至星形胶质细胞，实现了这些细胞中强烈且瞬时的基因表达。尽管gDAM展现出巨大潜力，研究人员承认，全面理解其机制仍需进一步研究。即便该系统在星形胶质细胞的特异性方面表现出色，但分子水平上的探索仍在进行中。此外，gDAM在人体中的安全性和可扩展性需要通过临床试验进行严格验证。
未来，我们的团队将继续深入研究gDAM方法，以厘清其分子和细胞机制。我们希望能将这种基因递送技术扩展到其他组织，如骨骼肌和皮肤，以突破DNA疫苗的主要瓶颈。
这项研究由一个多学科团队合作完成，团队成员分别来自首都医科大学、北京脑科学与类脑研究所、上海科技大学和康涅狄格大学。团队的专业领域涵盖神经科学、分子生物学和基因治疗，反映了他们在应对脑研究和治疗领域中一些最紧迫挑战方面的共同努力。周海滨博士以及博士研究生戴嘉婧和李栋为本篇论文的共同第一作者，孙文智研究员和胡霁教授为论文的共同通讯作者，首都医科大学为论文的第一作者和第一通讯作者单位。此外，研究团队的其他成员王璐遥，叶梦，胡晓玲和Joseph LoTurco教授为本文做出了重要贡献。本研究得到了科技创新2030计划和国家自然科学基金的支持。
