Nat Commun：四医大王亚云/杨雁灵/孙新等报道线粒体移植在神经系统疾病的新应用_

小脑退行性疾病以小脑共济失调为主要表现，线粒体功能障碍在疾病进展中至关重要，尤其是 Purkinje 细胞的线粒体损伤。线粒体移植作为一种新兴治疗方法，在神经系统疾病治疗方面展现出一定潜力，但在治疗小脑神经退行性疾病（CBND）的效果及分子机制方面尚未完全明确。近日，第四军医大学王亚云教授，第四军医大学西京医院肝胆外科杨雁灵教授以及第四军医大学西京医院儿科主任孙新教授在Nature communications杂志发表文章，提出线粒体移植能暂时缓解小鼠小脑神经退行性变，改善线粒体功能并减少线粒体自噬。

研究构建了 Purkinje 细胞中 Drp1 条件敲除的小鼠模型（PCKO 小鼠）以模拟小脑神经退行性疾病，发现其存在小脑萎缩、Purkinje 细胞退化和进行性共济失调等症状。通过向 1 月龄 PCKO 小鼠小脑移植肝源线粒体，可改善线粒体功能、减少线粒体自噬、延缓 Purkinje 细胞凋亡并缓解共济失调，效果可持续 3 周，但对成年 PCKO 小鼠无效。研究表明线粒体移植有望成为早期小脑神经退行性疾病的治疗方法。

Drp1基因在小脑Purkinje细胞中特异性敲除，同时以野生型（WT）同窝小鼠作为对照。PCKO小鼠和对照小鼠均存活、可育，且大小和体重正常。3月龄PCKO小鼠出现明显的小脑萎缩，免疫荧光染色显示其Purkinje细胞数量显著减少，且随着时间推移，Purkinje细胞数量进行性下降，分子层厚度也在2月龄时开始急剧减小。伴随Purkinje细胞的丢失，从1月龄开始，GFAP（星形胶质细胞标记物）和IBA1（小胶质细胞标记物）的强度逐渐显著增加，表明胶质细胞被激活。3月龄PCKO小鼠的Purkinje细胞中，DRP1蛋白和Drp1 mRNA水平均明显降低。对PCKO小鼠进行行为学测试，包括步态分析、转棒测试和平衡梁测试。结果显示，3月龄PCKO小鼠步态摇摆，4周龄时协调能力受损且症状逐渐加重，6周龄时平衡能力受损。这些结果表明PCKO小鼠存在运动功能障碍。PCKO小鼠呈现出小脑萎缩、Purkinje细胞神经退行性变和进行性共济失调的症状，且运动功能障碍和胶质细胞激活往往早于Purkinje细胞的丢失。这表明该模型成功模拟了小脑神经退行性疾病的病理特征，可用于后续研究。

图1在 Purkinje 细胞中条件性敲除 Drp1 基因构建小鼠小脑神经退行性疾病模型

鉴于PCKO小鼠存在线粒体缺陷，且线粒体移植对神经元疾病有良好治疗效果，研究人员探索线粒体移植治疗小脑神经退行性变的潜力，将野生型（WT）小鼠的肝源线粒体注射到PCKO小鼠的小脑中。从100mg肝脏组织中分离出健康线粒体，用Mitotracker染色来阐明其生物活性功能。观察到分离的线粒体呈现鲜艳的红色Mitotracker荧光，表明其生物活性功能完整。通过检测VDAC1蛋白进一步证实了线粒体的存在。使用 Mitotracker 对分离出的线粒体进行染色，在 37°C 孵育 30 分钟后，通过荧光图像显示线粒体具有生物活性。通过蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测线粒体蛋白 VDAC1，证实所分离物质为线粒体。检测线粒体的 JC - 1 水平（反映线粒体膜电位）和活性氧（ROS）水平，比较刚分离（0 小时）和分离 1 小时后的状态，结果表明两组在这两个指标上差异无统计学意义。

图2 将肝脏来源的游离线粒体移植到CBND小鼠退化的小脑中的策略

这组实验图像聚焦线粒体移植对CBND小鼠模型的影响。部分定量分析显示，线粒体移植使患病小鼠小脑面积有显著变化，或改善了小脑萎缩状况。部分借助三维成像直观展现不同小鼠小脑内部结构差异及移植影响，对小鼠小脑内相关结构荧光标记成像，可看出移植后细胞结构分布的改善。定量分析表明，线粒体移植对患病小鼠Purkinje细胞大小有积极影响，或有助于其形态和功能恢复。

图3 线粒体移植对小脑神经退行性疾病小鼠模型影响

给 1 月龄的 Pcp2 - Cre 小鼠（对照组）、CBNDgeneral小鼠（患病模型组）和CBNDgeneral+ Mito 小鼠（患病且接受线粒体移植组）注射靶向线粒体的病毒。21 天后，对它们的小脑进行切片，用于线粒体网络分析（MiNA）。另外，分离三组小鼠小脑的线粒体，以评估 Purkinje 细胞中的线粒体功能，并检测呼吸链复合物（Complex I - V）的蛋白水平。MiNA 结果显示，线粒体移植显著减轻了CBNDgeneral小鼠线粒体网络的破坏。线粒体移植显著提高了CBNDgeneral小鼠小脑的 ATP 水平，增强了线粒体膜电位（用 TMRM 染料检测），并减少了线粒体活性氧（ROS）的产生（用 MitoSox 染料检测）。线粒体移植显著缓解了CBNDgeneral小鼠中呼吸链复合物 III（CIII）和复合物 V（CV）的下降。总体而言，该研究表明线粒体移植对青春期CBNDgeneral小鼠 Purkinje 细胞的线粒体形态和功能有显著的改善作用。

图4 线粒体移植对青春期CBNDgeneral小鼠 Purkinje 细胞（PCs）线粒体形态和功能的影响

研究人员探究线粒体移植在 CBNDgeneral小鼠中的有效性是否源于Purkinje细胞中DRP1的恢复，结果Calbindin和DRP1共染色显示移植未上调DRP1水平。RT-qPCR检测发现，1月龄CBNDgeneral小鼠小脑内与共济失调相关分子的mRNA水平显著低于同龄野生型小鼠；Western blot分析证实，其小脑中线粒体动力学相关蛋白及线粒体抗氧化因子SOD1的表达水平显著降低，磷酸化DRP1与对照组无差异。免疫荧光染色表明，CBNDtdTomato小鼠Purkinje细胞中Caspase3和PARKIN表达水平升高、COX4降低，线粒体移植显著逆转这些变化。检测线粒体自噬相关分子发现，线粒体移植显著减轻LC3B上调，CBNDtdTomato小鼠的PINK1、BNIP3L、FUNDC1在特定月龄显著升高，BNIP3水平与对照组无差异，且移植未改变PINK1、BNIP3、BNIP3L、FUNDC1的表达水平。