Adv Sci: 殷善开/李春燕/刘峰团队发现“代谢废物”-胆红素靶向WNK1抗炎的新机制_

炎症是噪音、药物、病原体入侵等因素引起耳蜗及听觉中枢损伤的共性机制，因此，“抗炎”已成为保护听力的关键战场！作为人体自带的“灭火卫士”，内源性抗炎物质既能精准锁定炎症靶点，又能依托天然代谢路径实现安全调控，为脆弱敏感的耳蜗和听觉中枢提供炎症防御！

近日，上海交通大学医学院附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科殷善开、李春燕及刘峰课题组在Advanced Science 期刊发表题为Bilirubin Targeting WNK1 to Alleviate NLRP3-mediated Neuroinflammation的研究成果，揭示了内源性小分子胆红素在听觉中枢神经炎症调控中的关键作用及其特异性分子靶点。

胆红素（Bilirubin）是一种内源性代谢产物，课题组既往发现，在新生儿病理性黄疸期，过高浓度的胆红素可协同酸中毒诱导神经元损伤（Yin SK, et al. Sci Transl Med. 2020）。然而，近年来大量研究表明，胆红素不仅是传统认为的“代谢废物”，而是一种具有强抗炎和抗氧化活性的生理性“类激素”，轻度升高的胆红素与多种炎症和氧化应激相关疾病的发生发展呈负相关，并在炎症性疾病的干预中展现出广阔前景（Li CY, et al. Mater Today Bio. 2023; Leslie M. Science. 2023）。尽管胆红素在炎症调控中的作用已得到广泛关注，其具体的分子机制仍不明确。解析胆红素的作用靶点不仅有助于深入理解其生物学功能，还能为其临床应用提供理论依据。

既往研究表明，磷酸化调控是胆红素发挥生物学功能的重要机制。因此，本研究利用定量磷酸化蛋白质组学对胆红素处理后的耳蜗核组织进行系统分析，筛选出差异磷酸化蛋白及其磷酸化位点。为进一步鉴定胆红素的直接结合靶点，我们采用了细胞热稳定性分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA），该技术通过测定蛋白在胆红素存在下的热稳定性变化，筛选可能的胆红素结合蛋白。磷酸化蛋白质组学与 CETSA 富集分析共鉴定出 38 个候选蛋白，其中 WNK1（With-No-Lysine kinase 1）表现出最显著的差异。

WNK1 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因其激酶结构域的第 2 亚基缺乏典型的赖氨酸残基（用于 ATP 结合）而得名。WNK1不仅与 Gordon 综合征（遗传性高血压）相关，还在胚胎发育和炎症调控中发挥重要作用。分子对接模拟显示，胆红素与WNK1激酶结构域具有高亲和力，微量热泳动实验（MST）进一步证实了两者的直接结合（Kd = 67.2 nM）。激酶活性测定表明，胆红素可增强 WNK1 的激酶活性。

机制研究发现，在耳蜗核及海马组织中，胆红素通过靶向结合WNK1，激活其下游的 SPAK/OSR1-KCC2 信号通路，提高神经元内氯离子浓度，从而抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体活化。为验证胆红素水平对炎症的影响，我们构建了胆绿素还原酶（Blvra⁻/⁻）或 UDP-葡糖醛酸基转移酶1（Ugt1a1⁻/⁻）基因敲除小鼠模型，以分别模拟低胆红素和高胆红素状态。与野生型小鼠相比，Blvra⁻/⁻ 小鼠在LPS诱导下表现出更严重的炎症反应，而Ugt1a1⁻/⁻ 小鼠的炎症反应显著减轻。此外，在海马脑区条件性敲除WNK1后，胆红素的抗炎作用被显著抑制，进一步证实胆红素通过WNK1-SPAK/OSR1-KCC2轴发挥抗炎作用。

进化保守性分析表明，多种哺乳动物的WNK1激酶结构域呈现出高度保守性，提示WNK1可能是胆红素作用的跨物种共同靶点。为进一步解析胆红素-WNK1结合的下游效应，我们在神经元中敲除WNK1并进行磷酸化蛋白质组学分析，结果显示，差异磷酸化蛋白主要涉及微管相关过程、RNA加工、细胞周期调控、DNA损伤修复、昼夜节律调节及 IL-2/IL-18 信号通路等生物过程。这些结果表明，胆红素靶向结合WNK1可能影响广泛的生物学功能，进一步拓展了胆红素在炎症调控中的研究前景。