J Neuroinflamm：抑制SPAK能减少脑炎模型中的T细胞侵入和髓鞘损失

改变疾病进程的疗法通过预防免疫细胞浸入大脑在多发性硬化症（MS）治疗中显示出疗效。然而，其不可预测的不良反应促使需要开发更安全的治疗替代方案。脉络丛（ChP）作为抵御免疫细胞入侵的关键屏障，先前的研究表明，阻止免疫细胞穿过ChP的浸润可以减少MS动物模型中的脑部病灶。

近期，宁波大学李惠利医院（宁波大学附属李惠利医院）在Journal of Neuroinflammation杂志发表题为“Target inhibition of SPAK in choroid plexus attenuates T cell infiltration and demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis”的文章，揭示脉络丛中SPAK的靶向抑制减轻了实验性自身免疫性脑脊髓炎中的T细胞浸润和脱髓鞘现象（本研究SPAK过表达及干扰rAAV2/5病毒产品由维真生物助力提供）。

文章主要内容

了解ChP屏障的调控机制对于识别MS的新治疗靶点至关重要。在此，作者探讨了Ste20相关富含脯氨酸/丙氨酸激酶（SPAK）在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的作用。利用免疫荧光技术在EAE模型中检测了ChP中SPAK信号通路的表达模式。

为研究SPAK、基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9在EAE病理中的作用，通过脑室内注射重组腺相关病毒2/5（rAAV2/5）进行了ChP特异性的基因操作。利用CD4免疫染色和流式细胞术分析了T细胞向中枢神经系统的浸润情况。在体外通过细胞免疫荧光、Transwell实验和挽救实验研究了SPAK对ChP上皮屏障完整性的影响。此外，作者还采用药理学方法评估了SPAK-Na-K-2Cl共转运体-1（NKCC1）抑制剂（ZT-1a和布美他尼）在EAE期间对免疫浸润和脱髓鞘现象的保护作用。

图1.

EAE进展过程ChP中SPAK-NKCC1信号通路组分的时间表达谱

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作者利用MOG 35−55诱导的小鼠模型研究了EAE进展过程中大脑中SPAK的表达模式。免疫荧光分析显示，与第0天的基线水平相比，ChP中SPAK的表达从第8天（EAE发病前阶段）到第20天逐渐增加。类似地，p-SPAK的水平在第8至20天期间也有所升高。

由于已知活化的SPAK会磷酸化NKCC1，还检测了p-NKCC1的水平，并观察到在同一时期其磷酸化水平显著增加。形态学分析证实，SPAK-NKCC1的激活定位于脉络丛上皮细胞。Western blot分析进一步表明，SPAK、p-SPAK和p-NKCC1的蛋白水平从第8天到第20天逐渐增加，与免疫荧光结果一致。这些发现表明，ChP组织中SPAK信号通路的增强可能参与了EAE的病理过程。

图2. ChP特异性SPAK敲低改善EAE病理

为了研究ChP中SPAK信号在EAE中的具体作用，作者通过脑室内注射rAAV2/5-U6-shRNA-SPAK-EGFP（SPAK-Kd）或rAAV2/5-U6-scramble-EGFP（scramble）实现ChP靶向的SPAK敲低。

注射后14天，EGFP表达仅在ChP中检测到，其他脑区未见信号。免疫染色证实，SPAK-Kd病毒将ChP中SPAK蛋白水平降低了约60%。在MOG 35−55免疫后，SPAK-Kd小鼠表现出显著较轻的EAE症状，与对照组相比差异明显。EAE诱导后第21天的MBP染色显示，SPAK-Kd小鼠的脱髓鞘程度显著减少。在脊髓中，scramble组小鼠显示出大量CD68和Iba1双阳性细胞，而SPAK-Kd小鼠的CD68+/Iba1+细胞数量显著减少。

对小胶质细胞的三维重建揭示了两组之间的显著差异：对照组小胶质细胞表现为细胞体增大、分支减少且树突变短，而SPAK-Kd组小胶质细胞则表现为细胞体较小、分支增多且树突延长。这些结果表明，ChP特异性SPAK敲低有效减轻了中枢神经系统炎症并改善了EAE病理。

与对照组相比，SPAK-Kd小鼠在ChP中积累了显著较少的CD4+T细胞。在EAE诱导后第14天，H&E染色显示SPAK-Kd小鼠脊髓中的免疫细胞浸润减少。同样地，免疫荧光分析也表明，在这一时间点SPAK-Kd小鼠脊髓中的CD4+ T细胞浸润显著减少。

图3. ChP特异性SPAK过表达加剧EAE病理

鉴于在EAE中观察到SPAK信号的升高，作者假设ChP中SPAK表达的增加会加速疾病进展。为验证这一假设，通过脑室内注射rAAV2/5-CMV-SPAK（SPAK-OE）或rAAV2/5-CMV-EGFP（对照）诱导ChP特异性的SPAK过表达。

注射后14天，SPAK-OE小鼠显示出更高的ChP SPAK蛋白水平，且增强的SPAK荧光信号仅局限于ChP。在MOG35−55/CFA免疫后，SPAK-OE小鼠表现出比对照组更为严重的EAE症状。在EAE诱导后第21天，MBP染色显示SPAK-OE小鼠的脱髓鞘程度更为广泛。此外，H&E染色表明SPAK-OE小鼠脊髓中的免疫细胞浸润显著增加。

进一步分析发现，SPAK-OE小鼠表现出更强烈的炎症反应，表现为脊髓中CD68+/Iba1+双阳性细胞数量增加。在EAE诱导后第14天对ChP组织的分析显示，SPAK-OE小鼠中CD4+T细胞的积累增加，表明T细胞通过ChP屏障的浸润增强。这些结果表明，ChP中SPAK信号的升高通过促进T细胞浸润和中枢神经系统损伤而加剧了EAE病理。

图4. ZT-1a对SPAK的抑制显示出对EAE病理的保护作用

为了评估SPAK-NKCC1抑制剂在多发性硬化症治疗中的潜在疗效，作者在EAE诱导后每日腹腔注射SPAK抑制剂ZT-1a或对照溶剂。结果显示，ZT-1a治疗显著降低了EAE的临床评分，并减轻了髓鞘丢失。此外，ZT-1a减少了脊髓中的免疫细胞浸润和炎症反应，表现为CD68+/Iba1+双阳性细胞数量的减少。免疫染色显示，ZT-1a治疗减少了ChP中以及脊髓中CD4+ T细胞的浸润。

图5. 脑室内注射布美他尼改善EAE病理

布美他尼是一种经FDA批准的NKCC1抑制剂，常用于治疗水肿相关疾病。然而当通过腹腔注射给药时，布美他尼对EAE临床评分未显示出改善，这可能是由于其对中枢神经系统的渗透性较差。为克服这一限制，作者在EAE诱导后通过每日微量泵直接进行脑室内递送布美他尼。这种针对中枢神经系统的递送方法显著改善了EAE的临床评分，增强了髓鞘的保护作用，并减少了T细胞通过ChP浸润中枢神经系统的情况。鉴于T细胞浸润主要发生在EAE发病至临床评分峰值之间的时间段，在EAE诱导后的第8至14天评估了ICV布美他尼的给药效果。结果表现为EAE临床评分的降低、髓鞘丢失的减少，以及通过脉络丛浸润的CD4+T细胞数量的下降。

研究结论

作者的研究表明ChP中的SPAK信号通路是多发性硬化症治疗的一个有前景的靶点。

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