来源：生命科学前沿
乔雪，北京大学药学院、北京大学-云南白药国际医学研究中心研究员，博士生导师。2003年-2009年，北京大学，药学院（六年制），学士、硕士；2009年-2012年，北京大学，药学院天然药物学系，博士。2012年-2018年，北京大学，药学院天然药物学系，讲师；2016年-2018年，英国John Innes Centre，访问学者/博士后；2018年-至今，斯北京大学，药学院天然药物学系，副教授、研究员。2024年获国家杰出青年科学基金。
乔雪研究员针对中药药效成分发现与获取困难的科学问题，乔雪研究员潜心开展研究，为科学解读中药学原理、推动中药资源可持续利用作出了贡献。针对药效成分发现困难，她建立化学分析新方法及代谢分析新策略，显著提高了检测效率，深入解析了甘草、葛根芩连汤等中药的化学组成及体内活性成分。针对药效成分获取困难，她探索中药生物合成酶的发现、改造、组合催化应用新策略，发现40余个新颖的生物合成酶，定向合成百余种化合物，为常规方法难以获得的活性成分提供了绿色高效的制备途径。凭借以上研究结果，她在PNAS、J Am Chem Soc、Angew Chem Int Ed、Anal Chem等期刊发表SCI论文90余篇，获批专利10余项。此外，乔雪获教育部高等学校科学研究优秀成果奖（自然科学一等奖，第二完成人），受邀担任Fitoterapia期刊副主编，及J Pharm Anal等5种期刊编委/青年编委，入选国家“优青”、北京市“杰青”、中国科协青年人才托举工程等人才计划。她于2022年获北大医学青年科技奖，2023年获北大王选青年学者奖。在此，我们汇总了乔研究员的代表性论文与大家一起分享，内容如下，
Nat. Commun.：理解芹糖苷类成分的生物合成步骤
芹糖是一种含有叔醇基团的支链戊糖。目前已报道约1200个植物来源的芹糖苷，其中黄酮类芹糖苷占比最大，且在植物生长调控中发挥类激素作用。但是芹糖苷类成分的生物合成途径尚不清楚，芹糖转移酶的催化机制亦不明确。由于其结构特殊，化学合成芹糖基团步骤繁琐且不经济。因此挖掘可识别催化芹糖的糖基转移酶具有重要意义。
在豆科植物甘草中，芹糖甘草苷是其主要活性成分之一，因此北京大学叶敏教授和乔雪研究员等人根据芹糖甘草苷在甘草植株不同部位的成分含量差异及基因表达差异，利用“全基因关联分析法”挖掘得到芹糖转移酶GuApiGT，是自然界发现的第一个酚类芹糖转移酶。通过晶体结构分析、分子对接与动力学模拟、理论计算、定点突变实验等系列研究，验证了R368L369G370S371D372H373关键Motif对GuApiGT芹糖供体选择性的重要性。进一步利用关键Motif挖掘得到了豆科植物中的121条芹糖转移酶候选基因，并验证了4条基因的功能。最后，在本氏烟草中重构了芹糖甘草苷的从头合成途径，产量可达5.46 mg/g (DW)和4.73 mg/g (DW)。通过改变黄酮模块的基因组合，还成功实现了其它8种黄酮芹糖苷的合成。
文献链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-42393-1
Nat. Commun.：黄芪皂苷酰基转移酶的催化机制及理性改造
皂苷是分布广泛、结构复杂、活性多样的天然产物，常含有酰基化修饰。酰基化可以提升皂苷的生物活性，是药物结构修饰的重要手段。由于糖上不同羟基的化学环境相似，采用化学法定点酰基化修饰相对困难，寻找高效的生物催化元件十分必要。酰基化反应多由酰基转移酶催化，皂苷酰基转移酶数量极少，相似度低，发现新的催化元件存在困难，而中药黄芪含有大量的酰基化皂苷，是发掘新颖催化元件的适宜材料。
北京大学乔雪研究员和叶敏教授采用“分步BLAST”法，从膜荚黄芪（Astragalus membranaceus）中发现了第一例四环三萜皂苷酰基转移酶AmAT7-3，与已知的糖苷酰基转移酶序列有明显差异。AmAT7-3可催化黄芪皂苷木糖的3'和4'位发生乙酰化，生成多种黄芪皂苷。经多次尝试，作者解析了AmAT7-3和底物黄芪甲苷的共晶结构（PDB: 8H8I, 2.03Å），是第一个三萜酰基转移酶晶体。基于晶体结构及理论化学计算，发现AmAT7-3活性口袋内部的特异性小体积基序AADAG导致其具有很大的活性口袋，使得糖苷键可以在活性口袋内自由旋转形成两种构象，对应生成两个位点的乙酰化产物。同时，对活性口袋内部的氨基酸进行理性设计小型突变体库，成功实现了位点选择的蛋白质功能改造。最后，AmAT7-3及其突变体被应用到多种重要药用活性皂苷分子的乙酰化的定点修饰中。该研究进一步完善了黄芪皂苷生物合成的下游途径。
文献链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41599-7
PNAS：发现高等植物中夏佛塔苷生物合成的普遍途径
夏佛塔苷（Schaftside/isoschaftoside）是广泛分布于谷类作物和草药等高等植物中的生物活性天然产物，是普遍存在于高等植物的黄酮双碳苷，具有抗病毒等活性，也是重要的植保素。然而，对于这些具有不同糖残基的黄酮类二碳糖苷的糖基化生物合成途径知之甚少。
在这项研究中，北京大学叶敏教授和乔雪研究员等人发现黄芩、甘草等7种植物中夏佛塔苷均由CGTa、CGTb两个碳糖基转移酶依次催化Glu-糖基化、Ara-糖基化而生成，这两个酶具有截然不同的底物与糖供体选择性，并通过RNAi与过表达实验证明了体内功能。进一步通过1163种植物的转录组分析，发现该糖基化途径很可能在高等植物普遍存在。最后，解析了5个酶的晶体结构，发现His24 (SbCGTa)、His23 (SbCGTb)在两步碳糖基化过程中发挥重要的脱质子作用，同时根据活性口袋附近的11个差异氨基酸，设计多位点突变实现了SbCGTb向SbCGTa的功能切换。本文发现的CGT酶允许有效合成夏佛塔苷，这一普遍糖基化途径为研究高等植物的化学防御机制提供了平台。
文献链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2012745117
JACS：发现新型C-6/8双C-糖基转移酶GgCGT
C-糖苷是一类重要的天然产物，由于其强大的生物活性和对胃肠水解代谢的高稳定性，具有明显的可药用性。大多数C-糖苷来源于植物。生物合成上，它们是由C-糖基转移酶（CGTs）催化形成的。虽然已知O-糖基转移酶（OGTs）的一个大家族，但从植物中发现的CGTs数量有限，部分原因是由于CGT的基因序列相似性低。另一方面，人们对CGT的催化机制也知之甚少。
在此，北京大学叶敏教授、乔雪研究员和马明研究员等人从光果甘草发现新颖的C-6/8双C-糖基转移酶GgCGT。GgCGT能够催化弗洛丙酮单元发生连续两步C -糖基化反应生成双葡萄糖碳苷产物。课题组分别解析了GgCGT与根皮素、根皮素单碳苷两种底物，以及与UDP-Glc、UDP-Gal两种糖基供体的复合物晶体结构，这是第一个双C-糖基转移酶的晶体结构。结构分析阐明了GgCGT糖供体选择性（D390等关键氨基酸与糖基4-OH之间的氢键作用）。GgCGT的二-C-糖基化能力归因于一个宽敞的底物结合隧道，G389K突变可以将二-C-葡萄糖基化转换为单-C-糖基化。GgCGT是第一个具有晶体结构的二-C-糖基转移酶，也是第一个具有包含糖受体的复杂结构的C-糖基转移酶类。这项工作可能有利于开发高效的生物催化剂来合成具有药用潜力的C-糖苷。
文献链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b12211
Angew（Hot paper）：发现首个催化黄酮C-8位糖基化的碳糖基转移酶TcCGT1
碳苷是一类具有重要生物活性的天然产物，也是多种常用中药的药效成分。通过化学合成方法构建C -糖苷键仍然存在一定的挑战。碳糖基转移酶（CGT）是催化形成C -糖苷键的生物合成关键酶，具有绿色、高效、选择性强等特点。然而，由于基因同源性低等原因，目前从植物发现的CGT报道较少，对中药来源植物的研究更少。
北京大学叶敏教授、乔雪研究员和云彩红教授等人从金莲花发现首个催化黄酮C-8位糖基化的碳糖基转移酶TcCGT1。牡荆苷、荭草苷等黄酮8-碳苷是清热解毒中药金莲花的主要活性成分。课题组通过基因挖掘与功能表征，发现TcCGT1能一步高效催化合成牡荆苷等36种碳苷类化合物，并且解析了第一个植物来源CGT酶的晶体结构（分辨率1.85Å）。进而初步阐明了TcCGT1催化C-、O-糖基化的分子机制。分子对接揭示了TcCGT1催化机制的新模型，该模型由底物的自发脱质子化引发。宽敞的结合口袋解释了底物的混杂性，底物的结合姿势决定了C-或O-糖基化活性。此外，作者通过定点突变实现了由C-糖基化向O-糖基化的功能转变。TcCGT1是第一个具有晶体结构的植物CGT，也是第一个描述的黄酮8-C-糖基转移酶。这为设计高效的糖基化生物催化剂提供了基础。
文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ange.201905505
Angew：建立植物苯乙醇苷的多酶一锅法组合生物合成策略
来自植物的天然产物具有骨架特异、后修饰多样的特征，为其发挥各类活性提供了化学空间。在植物中，结构多样性由生物合成酶在骨架上连接不同的砌块而形成。苯乙醇苷是重要的药源分子，也是典型的“砌块组装”式天然产物，具有丰富的结构多样性，组合生物合成成为解决其来源问题的理想方法。但是，苯乙醇苷的生物合成途径尚未完全阐明。
在这项研究中，北京大学乔雪研究员以富含苯乙醇苷的中药连翘和大叶紫珠为材料，挖掘苯乙醇苷的生物合成关键酶，包括4个功能新颖的苯乙醇苷6’-O-糖基转移酶和3个底物谱广泛的多酚氧化酶。揭示了这类成分可能的生物合成复杂网络途径，与此前报道的线性途径不同。过序列比对和晶体结构分析，发现#144位点是影响糖基转移酶供体选择性的共性氨基酸残基，基于此位点实现了系列苯乙醇苷糖基转移酶FsGT61、CmGT3、FsGT6的糖供体选择性改造，获得了一系列高效专一的催化元件。获得的酶和突变体应用于苯乙醇苷的合成，建立多酶一锅法级联反应体系。通过投入不同酶和砌块，可实现26个苯乙醇苷的组合合成，转化率为5-100%，理论产率1.0-63.3 μg/mL。还可生成20种微量苯乙醇苷。此外，通过活性筛选，发现糖基化和羟基化明显提升苯乙醇苷的保肝活性。该研究体现了组合合成对重现和创造天然产物结构多样性的潜力，为苯乙醇苷类化合物的生物制造和药理活性深入研究奠定了良好基础。
文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202402546
Angew：三萜3-/6-/2'-O-糖基转移酶AmGT8的功能表征、定向改造及催化机制
黄芪皂苷是黄芪中一类以环黄芪醇为骨架的三萜皂苷，也是传统中药黄芪的主要药效成分，具有保肝、抗病毒、保护心血管和免疫调节等药理活性。虽然总含量较高，但黄芪皂苷结构多样，且缺乏紫外吸收，分离纯化存在很大困难。采用生物合成的手段制备黄芪皂苷，是解决这一问题的有效方法。黄芪皂苷的合成途径大致分为四类反应：骨架生成、氧化/环化、糖基化、酰基化。植物体内的糖基化反应可由糖基转移酶（GT）催化，而催化环阿屯烷型三萜的GT酶尚未报道。此外，由于三萜分子明显大于黄酮、酚酸等天然产物，三萜糖基转移酶的催化机制往往不清楚，其催化功能的改造也具有较大难度。
在这项研究中，北京大学乔雪研究员和叶敏教授等人以膜荚黄芪为研究对象，从中挖掘到第一个环阿屯烷型三萜糖基转移酶AmGT8，其催化环黄芪醇的3-OH及2-OH发生连续两步的糖基化反应，生成相应的双糖产物。通过半理性设计，首次实现了三萜类GT酶的位点选择性改造，通过单点突变，获得分别具有3-/6-/2'-O-糖基化三种不同功能的突变体A394D、A394F和T131V，将其应用于黄芪皂苷的生物合成中，并对催化机制进行了阐释。研究还发现A394位点可应用于改变其它植物GT的位点选择性，具有一定的普适性，为植物糖基转移酶的催化功能改造及黄芪皂苷的酶催化合成提供了新的思路。
文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202113587
Plant Biotech. J.：系列黄芪皂苷的组合催化合成
目前从中药黄芪中报道过22种环阿屯醇型皂苷，包含14种不同的糖取代类型。包括环黄芪醇3-O-木糖/葡萄糖基化、6-O-葡萄糖基化、25-O-葡萄糖基化。部分黄芪皂苷含量很低，药理活性研究有限。
在AmGT8的基础上，北京大学乔雪研究员和叶敏教授从黄芪中继续筛选得到多个糖基转移酶：AmGT1可催化环黄芪醇C3-OH糖基化，对UDP-Xyl有较好的选择性，能同时利用UDP-Glc等10种糖基供体，是已知供体选择性最广泛的三萜GT酶；AmGT5可催化环黄芪醇C3-OH的糖基化，但对UDP-Glc选择性更高；AmGT9可催化环黄芪醇C25-OH的糖基化，是第一个催化环阿屯烷型三萜侧链羟基的糖基转移酶。通过定点突变获得AmGT1G146V/I突变体，可专一利用UDP-Xyl。利用AmGT1/9及AmGT1G146V/S，与已报道的AmGT8及其突变体AmGT8A394F联用，实现了黄芪中13个环阿屯烷型皂苷的组合合成，转化率为22.6%~98.7%。此外，来自黄芪的糖基转移酶还可用于合成新颖黄芪皂苷、稀有或新颖的人参皂苷，为三萜皂苷的生物催化提供了工具。部分糖基化产物的保肝活性或抗新冠病毒活性明显增强。
文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13983
J. Adv. Res.：黄芪氧鲨烯环化酶的催化功能及催化机制
多数豆科植物都含有β-香树脂烷型三萜皂苷，但仅有黄芪等少数植物以环阿屯烷型三萜为主要成分。为阐明黄芪中环阿屯烷型三萜的合成机制，北京大学乔雪研究员和英国约翰英纳斯研究中心Anne Osbourn教授等人从膜荚黄芪中筛选得到了2条OSC基因，AmOSC2和AmOSC3。通过在烟草和酵母中的异源表达，鉴定了AmOSC3和AmOSC2分别为环阿屯醇合酶和β-香树脂醇合酶；采用过表达及RNAi证实它们在黄芪体内分别参与环阿屯烷型皂苷（如黄芪皂苷）和齐墩果烷型皂苷（如大豆皂苷I）的生物合成。同时，该研究还发现了β-香树脂醇/环阿屯醇合酶的氨基酸保守区VFM/VFN，通过对不同物种的10条OSC酶的定点突变，证实了该保守区对OSC催化功能有重要作用，是决定产率的关键因素。该研究鉴定了参与黄芪皂苷合成首步次生代谢反应的OSC酶，并为OSC功能改造提供了新的关键保守位点。
文献链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123222000765
