来源：生命科学前沿
快速生成化学修饰的长pegRNA用于引导编辑
由于固相合成长PEG引导RNA（pegRNA）（>125 nt）的挑战，使用核糖核蛋白（RNP）和RNA递送的引导编辑（PE）的编辑效率目前还无法优化到最佳情况。在此，武汉大学殷昊教授等人开发了一种高效、快速和成本效益高的方法，用于产生化学修饰的pegRNA（125-145 nt）和工程化pegRNA（epegRNA）（170-190 nt）。使用优化的夹板连接（splint ligation）方法，作者实现了RNA（称为L-pegRNA和L-epegRNA）约90%的生产效率。与体外转录产生的epegRNA相比，L-epegRNAs在各种细胞系和人类原代细胞中显示出增强的编辑效率，使用RNP递送时提高了十倍以上，使用PE的RNA递送时提高数百倍。此外，L-epegRNA介导的RNP递送也优于质粒编码的PE。该研究为获得高质量的pegRNA和具有所需化学修饰的epegRNA提供了一种解决方案，为PE在治疗和其他各个领域的应用铺平了道路。相关工作以“Rapid generation of long, chemically modified pegRNAs for prime editing”为题发表在Nature Biotechnology。
【文章要点】
RNA连接能够使用小片段产生相对较长的RNA分子。RNA连接酶通过连接具有5′-磷酸和3′-羟基末端的RNA片段来促进这一过程，一些连接酶还可以将RNA片段与2′，3′-环磷酸和5′-羟基端连接。夹板连接使用夹板DNA将RNA片段的末端杂交，并直接连接3′和5′末端的连接酶活性。虽然夹板连接的效率各不相同，但通常仍然很低，RNA连接产物的低产率限制了其广泛应用。在这里，作者优化了夹板连接的各种参数，并将其应用于有效地产生高产率和纯度的化学修饰的pegRNA和epegRNA，即L-pegRNA和L-epegRNA（图1）。
图1 连接的pegRNA介导高效PEL-epegRNAs的效力在不同的细胞系和人类原代细胞中进行了检测。与IVT产生的epegRNA相比，L-epegRNA通过RNA递送使PE的编辑效率提高了数百倍。L-epegRNA还大大提高了RNP格式PE的编辑效率，使PE的RNP递送在大多数比较中的编辑效率超过了质粒编码的PE。此外，作者还产生了化学修饰的epegRNAs，用于相对较大的插入，而210和234 nt RNA超出了目前固相合成的极限。这些epegRNAs分别通过RNP或RNA递送实现约60%的17bp插入效率和约20%或25%的40bp插入效率（图2）。L-epegRNA通过RNP和RNA递送显著提高了PE的效率，降低的成本和高效的连接过程将促进L-epegNA的广泛使用。
图2 pegRNA不同连接策略的比较原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02394-x
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