北京大学刘涛教授/浙江大学顾臻教授合作，最新Nature Materials！

来源：生命科学前沿

腺相关病毒（AAV）是目前体内基因治疗最重要的递送工具之一，但一个长期难题始终没有真正解决：病毒进入体内后，如何只在需要治疗的组织“开工”，而尽量避免在其他器官产生非特异性转导？传统方法通常依赖AAV天然组织嗜性、衣壳定向进化、受体配体改造或组织特异性启动子，但这些策略要么难以彻底消除原有嗜性，要么存在物种差异、制备复杂以及脱靶表达等问题。尤其是在全身给药时，病毒可能进入多个器官，增加安全性和免疫相关风险。因此，如果能像给AAV装上一把“可控开关”，让它在血液循环中保持沉默，只在目标组织、病灶微环境或外部刺激出现时恢复感染能力，就有望从递送源头提高基因治疗的时空精准性。

针对这一问题，北京大学刘涛教授联合浙江大学顾臻教授提出了一种“masked AAV”，即“掩蔽型AAV”策略。研究人员首先通过遗传密码子扩展，在AAV衣壳特定位点引入带四嗪基团的非天然氨基酸，再利用快速的四嗪-TCO生物正交反应，将PEG或AAV受体片段等“遮罩”精准连接到病毒表面，使AAV暂时失去感染能力；随后再利用肝脏特异性蛋白酶、近红外光或病理性活性氧（ROS）切断连接臂，去除遮罩，重新恢复AAV转导。研究最终实现了对肝脏、肌肉、脑和受损心肌的可控基因递送，并在心肌缺血再灌注损伤模型中进一步递送VEGF-A165，促进心肌修复。相关成果以“Controllable gene delivery via masked adeno-associated viral vectors”为题发表在《Nature Materials》上，Zhiying Zeng, Liying Chang, Jingjing Wang为共同第一作者。

研究的第一步，是先证明AAV真的能够被“严严实实地遮住”。研究人员选择AAV-DJ作为模型，将非天然氨基酸mPTet精准引入衣壳L585位点，这一位置靠近AAV与细胞表面受体结合的关键区域。与传统叠氮-DBCO反应相比，四嗪-TCO反应效率更高，可以在较低病毒浓度下更充分地完成衣壳修饰（图1a-c）。实验显示，当AAV表面接上较大的PEG，尤其是PEG20K后，细胞中的EGFP表达几乎完全消失；在小鼠体内，PEG20K修饰后的AAV同样几乎检测不到转导信号（图1d、e）。换句话说，这层“外套”能够通过空间位阻直接挡住AAV与细胞受体接触。研究人员还采用了另一种更像“假受体”的遮罩。AAV感染细胞时需要与AAV受体AAVR结合，因此团队截取AAVR中的PKD1、2结构域，并将其连接到AAV衣壳表面（图1f）。结果显示，无论在细胞还是小鼠体内，这种AAVR来源的遮罩同样可以几乎完全封锁AAV感染（图1g-i）。这意味着研究的关键并不是改变AAV本身的组织嗜性，而是先把原有感染能力暂时“关掉”，再决定在哪里重新打开。

图1

： 通过在AAV衣壳特定位点引入非天然氨基酸，并利用四嗪-TCO反应连接PEG或AAV受体片段，实现对病毒受体结合区域的精准遮挡，使AAV在细胞和小鼠体内基本失去感染能力。

有了“关机”能力，下一步就是让AAV在特定器官自动“开机”。研究团队首先选择肝脏作为验证对象。肝脏中特异性高表达的丝氨酸蛋白酶Matriptase-2（MT2）被设计成解锁信号。研究人员在遮罩与AAV之间加入MT2可切割的短肽连接臂，当AAV进入富含MT2的环境后，连接臂被切断，遮罩脱落，病毒恢复感染能力（图2a）。为了提高解锁效率，团队进一步比较了不同连接臂长度和MT2切割位点数量（图2b）。细胞实验发现，在没有MT2时，各种被遮罩的AAV几乎完全失去转导；加入MT2后，可切割版本的感染能力明显恢复（图2c）。在小鼠体内，优化后的v2-v4结构能够恢复肝脏转导，而不可切割对照以及连接臂过短的v1几乎没有信号（图2d、e）。研究人员随后又将遮罩模块从PKD蛋白替换为PEG，并将同样的设计推广到AAV8（图2f-k）。结果表明，这种“蛋白酶识别+遮罩脱落”的模式并不局限于单一AAV血清型，而是具有一定模块化和可移植性。

图2

： 构建MT2蛋白酶响应型掩蔽AAV。肝脏高表达MT2可切断遮罩连接臂并恢复病毒感染能力，实现静脉给药后的肝脏选择性基因转导，同时验证了PKD和PEG两类遮罩以及不同AAV血清型的适用性。

如果说MT2是由器官自己提供的“钥匙”，那么近红外光则给研究人员提供了一把可以从体外控制的“遥控钥匙”。团队设计了含花菁结构的近红外响应连接臂TCO-NIR-PEG20K。690 nm近红外光照射后，这一连接臂发生光化学断裂，使PEG从AAV表面脱落（图3a-c）。细胞实验表明，未照光时AAV基本处于关闭状态，而随着照射能量增加，病毒转导逐步恢复（图3d）。在小鼠肌肉中，局部近红外照射后，AAV-DJ-PEGNIR的荧光素酶表达可随照射剂量显著增强，100 J条件下相较未照射组提高约297倍（图3e、f）。将AAV9-PEGNIR注射至脑内后，局部照光同样能够恢复转导，荧光素酶信号提高73.6倍，并达到未掩蔽AAV9约56.1%的转导效率（图3g、h）。这说明AAV的感染能力不仅可以“开或关”，还可以通过光剂量实现一定程度的调节。

图3

： 利用690 nm近红外光切断光响应连接臂，使PEG遮罩从AAV表面脱落，实现对病毒感染能力的光控恢复，并在小鼠肌肉和脑组织中实现局部、剂量依赖的基因表达。

更关键的是，这种光控并不一定需要把AAV直接注射到目标组织。研究人员进一步进行全身静脉给药，再只照射需要表达的部位。结果显示，AAV9-PEGNIR在未经照射的区域保持低背景，而在近红外照射的肌肉区域，转基因表达相较未照射组提高5799倍，并且器官离体成像显示非靶向组织表达明显减少（图4a-d）。研究还将这一策略应用到具有脑部转导能力的AAV-PHP.eB。全身给药后，仅对脑部进行近红外照射，脑内荧光素酶信号提高134倍，脑/肝信号比由普通PHP.eB约3提高到100.6（图4e-h）。因此，这一设计实际上把“病毒去哪儿”部分转化成了“哪里照光，哪里表达”的空间控制问题。

图4

： 全身注射近红外响应型掩蔽AAV后，仅在局部照射区域恢复基因表达，实现肌肉和脑组织的空间选择性转导，并显著降低肝脏等非目标器官的脱靶表达。

除了器官特异性蛋白酶和外源光刺激，疾病本身也可以成为AAV的“启动信号”。很多炎症和组织损伤都伴随ROS升高。研究人员因此设计了含芳基硼酸结构的ROS响应连接臂TCO-BR-PEG20K。正常情况下，PEG遮罩阻止AAV与细胞结合；在过氧化氢等ROS升高时，硼酸结构被氧化，触发连接臂断裂并释放PEG（图5a、b）。在细胞中，AAV-DJ-PEGBR的感染能力随H₂O₂浓度增加而恢复（图5c、d）。随后，团队在四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠中进行验证。纤维化肝脏存在明显氧化应激，静脉注射AAV-DJ-PEGBR后，纤维化小鼠肝脏中的荧光素酶信号比健康小鼠高57倍，并且离体器官成像显示表达主要集中在肝脏（图5e-h）。这意味着病理微环境本身可以充当“密码”，让载体优先在病变组织中恢复活性。 

图5

： 构建ROS响应型掩蔽AAV，高水平ROS可切断芳基硼酸连接臂并释放PEG遮罩。该载体在肝纤维化模型中利用病灶氧化应激实现肝脏局部基因递送。

疗场景的心肌缺血再灌注损伤。心肌I/R损伤会产生大量ROS，因此研究人员将ROS响应遮罩设计移植到具有心肌转导能力的AAV9上，得到AAV9-PEGBR。静脉注射后，该载体在受损心肌中被局部激活，而在假手术小鼠中仅出现很低表达（图6a-c）。与未遮罩AAV9相比，AAV9-PEGBR的基因表达明显更集中于心脏，其心脏靶向效率达到95.9%，而未遮罩AAV9mPTet为63.5%（图6d）。团队随后将报告基因进一步替换成促血管生成因子VEGF-A165（图6e）。在心肌I/R小鼠中，AAV9-PEGBR介导的VEGF-A递送改善了28天后的射血分数和短轴缩短率，同时降低梗死面积和心肌纤维化程度（图6f-j）。与直接向心肌注射治疗基因相比，这一方案通过静脉给药，再利用受损心肌自身的ROS完成局部解锁，为“病灶自己打开治疗开关”提供了一个直观范例。

图6

： 将ROS响应型掩蔽策略应用于AAV9，在心肌缺血再灌注损伤产生的高ROS环境中选择性激活，并进一步递送VEGF-A165，改善心功能、减少梗死和纤维化。

小结

这项工作的核心价值，在于它没有继续单纯追求“制造一种天生只去某个器官的AAV”，而是换了一个思路：先把AAV原有感染能力彻底压住，再利用器官特异性酶、外部近红外光或疾病相关ROS，在真正需要的位置重新激活。遗传密码子扩展结合快速四嗪-TCO生物正交反应，使这种衣壳修饰能够做到位点明确、遮罩充分，并可在不同AAV血清型之间迁移。研究同时发现，掩蔽还能够延长AAV早期血液循环时间，并在一定程度上降低抗AAV抗体识别和中和。未来，如果进一步开发对缺氧、pH、一氧化氮、X射线或超声等刺激响应的连接臂，这种“先关闭、再按需开启”的递送逻辑，有望扩展到更多疾病和更多蛋白质递送平台。当然，近红外光在深部人体组织中的穿透能力、不同病灶刺激强度的个体差异，以及长期免疫安全性等问题，仍需要进一步验证。

来源：BioMed科技