前言
炎症是衰老的普遍特征，在组织功能障碍中，先天性和适应性免疫细胞发挥重要作用。在大脑中，小胶质细胞是常驻的多功能免疫细胞。在老年和神经退行性大脑中，疾病相关小胶质细胞表现出衰竭特征。
衰老是响应压力和组织老化的细胞命运保守机制。它在许多细胞类型和环境中表现出异质性，其特征是大分子和细胞器损伤、细胞周期停滞、衰老相关分泌表型 (SASP) 的产生。
本篇由梅奥诊所罗伯特和阿琳·科戈德衰老研究中心研究团队在Nature Communications期刊（IF:17.694）发表了题为“Rejuvenation of the aged brain immune cell landscape in mice through p16-positive senescent cell clearance”的研究成果，采用NanoString nCounter、单细胞测序技术，CyTOF等研究方法，发现了衰老小鼠大脑中衰老细胞的特性。表明衰老和炎症表达谱随着年龄的增长而增加，并且是大脑区域和性别特异性的。通过雌性p16-InkAttac小鼠p16 阳性衰老细胞清除实验，发现衰老指标部分恢复到年轻水平，揭示了衰老过程中大脑免疫细胞宏观的动态重塑，提示将靶向衰老细胞作为对抗炎症变化和认知能力下降的策略。
研究背景
作者假设 p16 相关的衰老机制可能调节与年龄相关的脑功能障碍，p16 阳性衰老小胶质细胞在新兴脑免疫中的分子特性以及全身细胞衰老在调节稳态脑炎症中的机制作用尚未见报道。此外，尽管衰老细胞及其 SASP 被认为是与年龄相关的组织炎症的驱动因素，但它们的靶向是否以及如何重塑受年龄影响的组织（包括大脑）中的免疫细胞组成尚不清楚。
本文作者利用单细胞技术、特定区域的转录分析技术、荧光成像和行为实验来研究晚年认知变化背景下与年龄和性别相关的稳态脑细胞衰老和炎症。研究结果揭示了在不同性别的细胞和转录水平上，大脑炎症激活谱存在显著的与年龄相关的多样性。通过体外和体内实验，作者证明了衰老的脑髓细胞的特征在于驱动外周免疫细胞趋化性的 SASP。重要的是，作者表明系统性靶向 p16 阳性衰老细胞可以部分恢复脑免疫细胞组成，改善认知功能。
研究思路
研究结论
1.衰老和炎症基因在不同性别和大脑区域的老年小鼠大脑中异上调
为了探索年龄对炎症稳态和衰老的影响，作者使用 NanoString nCounter 技术对海马、脑室下区等区分析了 800 个炎症和衰老相关基因的表达模式。6月大（年轻）与 24 个月大（年老）雌性和雄性小鼠。在雌性中，作者确定了 274 个受年龄影响的差异表达基因（图 1a）。在雄性中，作者确定了 141 个受年龄影响的基因（图 1a ）。15 个保守基因随着年龄和性别的增加而增加（图 1b）。接下来，研究了性别之间保守且不同的年龄和区域特异性表达模式，并确定了在单个大脑区域和性别中唯一差异表达的基因（图1a，c-e）。海马中的年龄依赖性表达谱似乎在两性之间最明显（图 1c）。对于脑室下区和小脑，雄性与雌性共享大部分差异表达的基因，在雄性中未发现更大比例的雌性年龄改变基因（图 1d，e）。
由于不同的衰老特征描述了不同性别和大脑区域，作者接下来考虑了所有年轻与老年基因的比较，以进行独创性途径分析（IPA）（图 1f）。作者观察到炎症通路呈现年龄依赖性增加，突触传递通路却减少，此外也发现特定通路在大脑区域和性别之间受到明显调节。因此，与年龄相关的衰老和炎症基因明显地表征了跨性别和大脑区域下的衰老大脑。
图1 | 衰老和炎症的基因在不同性别和大脑区域的老年小鼠大脑中受到不同的调节
2.p16 阳性衰老的脑髓细胞表现出SASP、MHC、溶酶体和稳态功能改变的标志
接下来，作者使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)在年轻和年老小鼠大脑中鉴定衰老细胞，重点关注雌性，因为它们与衰老相关的转录特征更明显（图1）。使用 10X 基于液滴的方法，作者从两个年轻和四个老年的脑单细胞悬液中回收了 6385 个细胞。使用 Seurat 分析流程，作者确定了六个不同的细胞簇（图 2a），这些细胞簇包括星形胶质细胞 ( Aldoc )、神经元 ( Snap25 )、少突胶质细胞 ( Mbp ), 骨髓细胞 ( Cx3cr1）、内皮细胞（Pecam1）和室管膜细胞（ Calml4）（图 2b）。
基于作者对衰老效应因子 Cdkn2a/p16 Ink4a在老年女性大脑中上调的大量基因表达观察，作者在特定细胞簇中搜索了Cdkn2a转录水平。骨髓细胞含有最高频率的Cdkn2a阳性细胞，星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞群含有较少的Cdkn2a阳性细胞（图 2c）。鉴于Cdkn2a信号的显著丰度，作者对骨髓簇进行了无偏连续聚类，并确定了一个富含Cdkn2a阳性细胞的单细胞群（图 2d，e ），随着年龄的增长而增加（图 2f）。基因集富集分析（GSEA）揭示了溶酶体功能的下调和趋化因子信号传导、核糖体功能和阿尔茨海默病的上调（图 2g、h）。
为了验证小胶质细胞对衰老大脑中衰老髓系细胞区室的贡献，作者分析了先前发表的scRNA-seq 数据。对应于 8 个年轻（2-3 个月）和 8 个老年（21-23 个月）小鼠脑单细胞悬液，小胶质细胞群之一包含最高频率的Cdkn2a阳性细胞，与骨髓簇 2 的基因表达谱（图 2g）显著一致。GSEA 揭示了与髓细胞簇 2 相似的功能评估（图 2h），累积地，两个独立的scRNA-seq 数据集揭示了一个脑小胶质细胞群作为Cdkn2a/p16 Ink4a在老脑中的阳性群，其特征在于衰老和 DAM/WAM 激活的重叠基因特征。
图2 | 单细胞 RNA 测序揭示了一个与年龄相关的Cdkn2a/p16 Ink4a阳性衰老髓系脑细胞群
3.p16 阳性衰老骨髓细胞在老年女性齿状回中积聚
接下来探讨了p16-InkAttac小鼠年轻和年老大脑中 p16 阳性骨髓细胞的特性和丰度，这些小鼠系统地消除了 p16 阳性细胞。作者使用 RNA 原位杂交和 IF 成像检测细胞的标志物。基于通过scRNA-seq转录特征，鉴定出p16 Ink4a +IBA1+ 细胞，其趋向于比年轻雌性小鼠丰富。
基于作者观察到老年大脑中p16阳性衰老髓细胞上调趋化 SASP 因子，作者设计了一个体外模型来测试衰老脑髓细胞的 SASP 是否驱动外周免疫细胞趋化性。在两周内将原代小鼠脑骨髓细胞暴露于 10 Gy X 射线照射（IR）诱导的衰老（图 3a，b）。具体来说，71% 的 IR 暴露的脑髓细胞对溶酶体应激标记物 SA-β-gal 呈阳性（图 3a）。在暴露于 IR 的培养物中，RT-PCR 基因表达谱显示衰老效应子p16 Ink4a和 SASP 因子显著增加。对分泌蛋白的分析显示，已建立和/或趋化 SASP 因子显著增加，包括 GDF15、CCL2/MCP1、CCL3/MIP1a和 TNFRSF1A。相对于假对照培养基，衰老的 IR 暴露培养物的培养基（图 3b）。
体外衰老脑髓细胞培养物与 scRNA-seq 结果的比较表明p16 Ink4a、MHC II 组分、CCL2、CCL3 和 CCL4 的共同上调，表明体外模型概括了体内衰老脑的关键趋化特征。作者还注意到模型差异，包括体内Spp1的上调和衰老骨髓培养基Spp下调（图3b）。作者接下来使用微流体迁移室系统测定衰老的脑髓样 SASP 是否化学吸引外周免疫细胞（图 3c）。由 T 和 B 淋巴细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和单核细胞组成的 GFP 阳性脾细胞优先向含有 SASP 蛋白的衰老培养基迁移（图 3d）。因此，衰老脑髓细胞的 SASP 驱动外周免疫细胞趋化。
图3 | 衰老的脑髓细胞分泌一种 SASP，可促进体外外周免疫细胞募集
4.通过 p16 阳性衰老细胞的全身靶向而减少激活的常驻浸润免疫细胞在老年大脑中积聚
接下来，作者进行了质谱流式细胞术来研究脑免疫细胞组成中与年龄相关的变化，并测试 p16 阳性衰老细胞的全身靶向是否会降低浸润性免疫细胞的丰度。20 种免疫标志物用于研究年轻与年老雌性和雄性p16-InkAttac小鼠脑细胞区室中的总 CD45+细胞。
根据类型和状态标记进一步分离七个集群，共 19 个不同的群体（图 4a）。在老年女性中，作者观察到 CD45+CD11b+CX3CR1 hi '稳态'小胶质细胞的频率显著降低，这是最丰富的 CD45+ 群体（图 4b）。与年龄相关的稳态小胶质细胞减少伴随着活化的常驻小胶质细胞和浸润免疫细胞的扩张。在男性和女性中，作者观察到两个活化的小胶质细胞群的频率随年龄增长而增加（图 4c）和（图 4d）。额外的小胶质细胞群在老年女性中的频率增加（图 4e）。
作者确定了三个共同表达 CD206 和 CD38 的群体（图 4f-h）。浆细胞样DC群体在老年女性脑中的频率增加（图 4j）。Ly6C+ 单核细胞群体（图 4k-m）和中性粒细胞群体（图 4n），它们显示出雌性的变异性。脑单核细胞在老年男性中增加（图4l )。CENPB 和 p21 是以前用于鉴定衰老细胞的标志物，在此鉴定了独特的单核细胞群（图 4m），表明在衰老女性大脑中的浸润性免疫群体在衰老细胞清除后恢复到年轻水平（图 4p）。所有 T 细胞群在老年女性大脑中增加，两个在老年男性大脑中增加（图 4q-t）。
作者的大规模细胞术结果表明，与男性相比，老年大脑与年轻大脑中的炎症细胞发生了动态重塑，激活的常驻小胶质细胞和浸润的免疫细胞区室，并在老年女性中更为明显。系统性靶向 p16 阳性衰老细胞的 AP 治疗显著降低了共表达 MHCII 和 CD11c 的小胶质细胞群（图 4e）的丰度，转基因衰老细胞靶向还减弱了浸润免疫群体（包括 B 细胞和 T 细胞）的年龄依赖性增加。
图4 | 质谱流式显示老年大脑中激活的常驻和浸润免疫细胞的频率增加，而系统性靶向女性 p16 阳性衰老细胞可减少这些细胞的频率
5. 在 p16 阳性衰老细胞靶向后，认知功能得以保留，并且与老年雌性小鼠中大量活化的小胶质细胞和浸润脑免疫群体有关
年老的雌性和雄性小鼠认知功能的指标明显低于年轻小鼠，雌性的年龄差异更明显（图 5a，b）。AP处理的老年雌性的筑巢质量和速度相对于年轻雌性没有差异，并且明显优于V处理的老年雌性，表明女性执行功能对系统性衰老细胞靶向的反应显著改善（图 5a ）。
接下来，作者实施了 Spearman 相关分析，以测试激活的脑免疫细胞群的丰度是否与认知结果相关。作者重点分析了用 AP 或 V 治疗的老年女性，以专门探索衰老细胞消除对脑免疫细胞组成和认知变化之间相互作用的影响（图 5c）。因此，激活的常驻和浸润性脑免疫细胞丰度与老年女性的认知功能障碍密切相关。
图5 | B细胞亚群功能的研究揭示了不同的代谢、生物合成和免疫信号活性
相关讨论
研究揭示了与认知变化同步的年龄和性别依赖性的免疫衰老脑细胞的动态变化。重要的是，证明了通过转基因方法系统性地靶向 p16 阳性衰老细胞是一种减轻与认知衰退相关的与年龄相关的脑炎症重塑的策略。
使用炎症和衰老基因组的 NanoString 转录组分析，发现女性和男性在大脑区域显示出不同且共享的年龄依赖性表达特征，海马模式更加不同。与男性相比，女性中年龄改变的基因总数更多，这可能反映了衰老反应放大、年轻女性基线表达较低和/或表达变异性较小的组合。
使用单细胞转录组测序scRNA-seq，确定了一个与年龄相关的髓细胞群，其特征在于衰老SASP、溶酶体应激和 MHC 激活的表达特征。通路分析揭示了细胞因子、溶酶体和核糖体功能的改变，以及与阿尔茨海默病的预测联系。总而言之，单细胞转录组学分析表明，衰老的骨髓细胞在老年大脑中积聚，并且可能是驱动与年龄相关的大脑炎症的化学引诱因子的重要来源。
使用体外系统，作者证明了 IR 诱导的衰老脑髓细胞在体内概括了衰老脑髓细胞的特征，包括含有溶酶体应激标记物以及上调和分泌SASP 因子。重要的是，作者发现脾细胞从衰老的脑髓细胞迁移到含有 SASP 的条件培养基，这表明这些细胞类型可能被衰老的脑髓细胞 SASP 募集。特定的外周免疫细胞特性和介导其趋化性的 SASP 分子是重要的未来方向。
通过认知行为测试，作者表明，与老年对照组相比，靶向老年女性的衰老细胞治疗提高了与执行功能相关的筑巢和学习和记忆相关的石迷宫导航的表现。最终证明与年龄相关的炎症性脑细胞成分与认知功能障碍有关，并且可以通过衰老细胞清除来部分恢复。
总的来说，作者研究揭示了在细胞、分子和功能水平上理解大脑衰老的新兴框视角。以最近的单细胞进展为基础，并证明老年大脑中的稳态炎症的特征是常驻衰老细胞的扩张和免疫群体的浸润。至关重要的是，表明 p16 阳性衰老骨髓细胞及其 SASP 可能介导外周免疫细胞募集以加剧衰老中的脑部炎症，并且 p16 阳性衰老细胞的全身消除可能会使脑免疫细胞组成恢复到更年轻的状态，同时改善认知功能。因此，研究结果暗示靶向衰老细胞是对抗与年龄相关的脑部炎症和保持认知功能的策略。
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研究采用纤维解剖NanoString nCounter技术，单细胞测序技术，免疫荧光和行为学实验在细胞、分子和功能水平上揭示了大脑衰老的新机制。并证明老年大脑中的稳态炎症的特征是常驻衰老细胞的扩张和免疫群体的浸润。
通过转基因小鼠和靶向策略证明 p16 阳性衰老细胞的全身消除可能会使脑免疫细胞组成恢复到更年轻的状态，同时改善认知功能。暗示靶向衰老细胞是对抗与年龄相关的脑部炎症和保持认知功能的策略。
使用NanoString 技术进行特定区域的转录组分析，使用scRNA-seq技术确定细胞分类亚群，利用体外系统，进行实验验证，证明特定的外周免疫细胞特性和介导其趋化性的 SASP 分子是重要的未来方向。最后，文章还提供了年轻（6 个月）和老年（24 个月）小鼠脑细胞的单细胞测序的公共在线资源。以上的新型技术手段给予科研工作者更多的启示。
综上，通过认知行为测试，作者表明，与老年对照组相比，靶向老年女性的衰老细胞治疗提高了与执行功能相关的筑巢和学习和记忆相关的石迷宫导航的表现。最终证明与年龄相关的炎症性脑细胞成分与认知功能障碍有关，并且可以通过衰老细胞清除来部分恢复。
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