前言
2022年11月，中国农业科学院麻类研究所功能纤维材料开发与利用团队在《BMC Plant Biology》期刊发表了题为“Metagenomic and proteomic analysis of bacterial retting community and proteome profile in the degumming process of kenaf bast”的研究成果，研究分析了在沤麻过程中与红麻韧皮纤维相关的微生物群落，以确定潜在的候选脱胶微生物。通过对收集沤麻液进行分析，评价不同沤制时间的红麻纤维产量和质量，运用宏基因组和蛋白质组学对微生物群落进行表征。
基本信息
中文标题：基于宏基因组学和蛋白质组学分析红麻脱胶过程中微生物群落与蛋白组变化规律
发表期刊：BMC Plant Biology
影响因子：5.260
作者单位：中国农业科学院麻类研究所
涉及的组学研究：宏基因组学、蛋白质组学
研究背景
红麻属锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hibiscus）一年生草本植物，是重要的韧皮纤维作物。红麻韧皮原料除含有大量的纤维素外、还含有果胶、半纤维素和木质素等“胶质”成分。为了获得高质量的纺织纤维原料，必须通过“脱胶”去除非纤维素物质。在崇尚“绿色、环保”的今天，红麻生物脱胶备受青睐。迄今为止，红麻脱胶的微生物群落和功能蛋白尚不清楚。此外，对功能微生物的筛选和遗传构建也缺乏理论依据。已有的研究主要集中在可培养过程中的芽孢杆菌、梭状芽胞杆菌、梭状芽胞杆菌和假单胞菌等。
本研究已确定了脱胶生态系统中的优势细菌，包括梭状芽孢杆菌、假单胞菌等细菌。一些细菌，特别是芽孢杆菌属、芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的成员，已被证明可以产生果胶酶。这些细菌的存在加速了脱胶过程。因此，鉴定与非纤维素降解酶（如：果胶酶等）相关的微生物可能对红麻脱胶过程有重要意义。
研究思路
研究结果
1.沤麻液的物理化学特性
发酵液和还原糖的pH值表征了发酵液过程中的生物发酵环境。pH值是影响微生物生长和脱胶酶活性的重要因素，一般理想的pH范围在6.5~8.0之间。随着沤麻时间的延长，沤麻液的pH值逐渐下降，10天后达到最低值（pH 6.4），此后pH持续升高，直到沤制34天，pH为7.3（图1）。与pH趋势一样，红麻发酵液中还原糖的含量在发酵早期（前10天）持续下降，然后逐渐增加（图1）。综上所述，在沤麻过程中，pH和还原糖含量的变化趋势呈现为“V”形。
图1 | pH值的变化及还原糖含量
2.红麻纤维的形态和产量
通过对不同发酵时间的出现进行定性分析。数据表明，随着沤麻时间的增加，红麻纤维的柔软度、分散度和纤维白度显著提高（图2A），说明沤麻时间的增加增强了脱胶效果。扫描电镜（SEM）可以清楚清晰地评估纤维表面形貌。扫描电镜结果表明，红麻纤维在发酵10天后被部分降解并开始分散。34天后，纤维完全分散，表面更平滑（图2B)。红麻纤维得率为63.9%。
图2 | 不同吸液时间的外观形态和纤维形态
3.宏基因测序分析
对原始序列分类分别为185个门、170个纲、352个目、795个科、3407个属。在门水平上，样品中最丰富的门是拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门。在基线和早期阶段，拟杆菌门的相对丰度没有显著差异。然而，在发酵结束时，拟杆菌门菌的丰度大大降低（图3A）。相反，变形菌门的丰度随着发酵时间的延长而增加（图3A）。与变形菌门相似，纤维杆菌随着吸液时间的延长而增加（图3A）。
在属水平上，普雷沃氏菌是最占优势的细菌。普雷沃氏菌在0d和10d的相对丰度约为55%，但在发酵结束时下降到21.27%（图3B）。此外，结果显示，不动杆菌的相对丰度从基线时的2.88%增加到第34d时的6.64%（图3B）。在沤麻阶段，梭状芽孢杆菌的一些成员从基线时的3%减少到脱胶后34d时的2%（图3B）。然而，其他几种平均丰度大于1%的细菌在各组间没有显著差异。
图3 | 样品中细菌的相对丰度
4.碳水化合物活性酶的分析
为了鉴定样品中的碳水化合物活性酶，作者将从微生物群落中鉴定出的蛋白质与CAZy数据库的整个非冗余序列进行了相似性搜索（图4A和B）。Kruskal-Wallis数据显示，糖苷水解酶家族（GHs）在34d中表达下调（图4C），而辅助活性（AAs）在34d中表达上调。苯醌还原酶、纤维二糖脱氢酶、葡萄糖1-氧化酶、芳醇氧化酶和醇氧化酶是发酵液中最丰富的酶。这些观察结果表明，随着脱胶的进行，碳水化合物的利用率不断变化。
图4 | 碳水化合物活性酶（CAZy）分析结果
5.蛋白质组学数据
PCA结果显示，0d的样本均位于第二象限；10d的样本位于第四象限（第三象限的一个除外），而34d的样本均位于第一象限。PCA显示总方差的28.87%（PC1）和18.33%（PC2）（图5A）。样本间相关分析显示，同一组样本具有较高的相关性（图5B）。数据表明，同一组的样品重复性良好。
图5 | 蛋白质组学数据分析
6.差异表达蛋白及功能分析
表达蛋白差异性及其功能进行分析，发现10d与0d比较，10d内高表达32、24，低表达；34d，DEPs上调51，下调30；34d和10d，DEPs分别上调和下调（图6A)。此外，作者绘制了一个热图来分析每次比较中DEPs的表达情况（图6B）。
蛋白注释信息进一步分析DEPs，发现上调的前5位（P37698、Q05120、P0A913、A6LEI8和B7JYG7）和下调的前5位的DEPs（P11221、Q3YUZ8、P0AY9Y8、Q97D82和P20148），倍数变化最大（图6C）。结果表明，部分的DEPs在10d时发生了显著变化，而其余的DEPs在34d时发生了显著变化。此外，所有DEPs的注释信息显示，P82593是一种重要的半纤维素。
KEGG富集分析对10d vs. 0d和34d vs. 0d鉴定的DEPs进行分析。结果显示，五种碳水化合物代谢相关途径的富集。以3个DEPs、P19543、Q1ACK0和Q59199为关键指标，这三个DEPs的丰度如图6D所示。
作者还分析了不动杆菌和梭状芽孢杆菌中蛋白的表达。不动杆菌的蛋白表达谱显示，随着反应时间的推移，B7GYR8、Q6RYW5和Q6FFK2的平均水平随着脱胶时间的延长而降低，而P05149的平均水平上调（图6E）。对于梭状芽孢杆菌中的蛋白，三个脱胶相关蛋白P37698、P52040和P54937随着取样时间的推移而上调（图6E）。
图6 | 蛋白质组学数据和重要差异表达蛋白（DEPs）的表达
7.冗余分析（RDA）
作者进一步强调了上述结果，结果表明，软壁门、变形菌门和厚壁菌门与pH值和还原糖含量呈正相关。拟杆菌门菌与pH呈负相关（图7A）。此外，利用RDA对上述前20个门和候选门进行分析。结果表明，厚壁菌门与Q07637、Q6RYW5、P0DM31、Q97D82和P11221呈正相关，而与Q6FFK2呈负相关。变形菌门与P82593呈正相关（图7B）。
图7 | 冗余分析（RDA）排序图
研究结论
不动杆菌和梭状芽孢杆菌可能在该红麻脱胶过程中发挥重要作用。
P37698、P52040、P54937和P82593蛋白的上调是脱胶过程中的重要表现形式，并起了重要作用。
P82593作为一种半纤维素酶，可能在红麻的脱胶过程中起决定性作用。
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本文首次采用宏基因组学和蛋白质组学结合的方法，分析红麻脱胶过程中微生物的多样性和功能蛋白的变化。此外，还筛选了河南信阳地区脱胶微生物的优势微生物和差异表达蛋白。本文的研究可为筛选红麻脱胶微生物和解析生物脱胶催化机理，提高红麻脱胶效率和纤维质量提供可靠依据。
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