脂质是细胞的细胞膜成分、信号分子，也是细胞的能量来源。脂质代谢的改变对癌症的进展至关重要，而脂质在癌细胞的增殖和转移中起着关键作用。此外，脂质组学正在深入了解疾病机制，并确定新的治疗靶点。新的证据表明，脂质代谢改变也在黑色素瘤的发展中区分良性皮肤肿瘤和黑色素瘤起着重要作用。
本篇为曼彻斯特大学Adam W. McMahon等研究课题组在医学一区《Cancer Research》期刊(IF:13.312)发表了题为“Enhanced fatty acid scavenging and glycerophospholipid metabolism accompany melanocyte neoplasia progression in zebrafish”的研究成果，本文中将转录组分析和基于质谱成像DESI-MS成像模式的空间代谢组学相结合，来研究致癌ras驱动的斑马鱼黑素细胞瘤中的脂肪酸摄取和脂质代谢。转录组分析确定了与疾病进展相关的基因表达程序，其中包括参与脂肪酸摄取和甘油磷脂代谢的基因。同时，FTHA的PET和DESI-MS成像均证实了脂肪酸摄取增强。DESI-MS空间代谢和常规质谱也证实了甘油磷脂代谢的增强，从而为肿瘤脂质代谢的异质性提供了相应的的见解。
研究背景
脂肪酸是复杂脂质并入膜的基石，以及β-氧化的底物，这是一种主要的能量生成反应。脂肪酸可以由脂肪酸合酶（FASN）从头合成。FASN在包括黑色素瘤在内的多种癌症中过表达，并在几十年来一直是药物开发项目的目标。最近的研究表明，与其他类型的癌症相比，携带长链脂肪酸的FATP1/SLC27A1在黑色素瘤中富集，因此强调了脂肪酸摄取对黑色素瘤进展的重要性。最近，转基因斑马鱼被用来揭示FATP1和BRAFV600E在刺激黑素细胞瘤变方面的协同作用，而黑色素瘤细胞移植到斑马鱼中则显示出优先转移到脂肪组织。
研究思路
实验方法
研究对象：斑马鱼
1.正电子发射断层扫描（PET）
2.解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）空间代谢组学研究及分析
3.转录组学研究及分析
4.代谢途径的脂质提取和质谱分析
5.转录组学和脂质组学分析
6.RNA分离和实时荧光定量qPCR分析
7.蛋白质印迹法
8.免疫组化
研究结果
1.转录组学分析揭示了晚期黑素细胞瘤中脂质代谢途径的解除调控
首先作者构建了不同级别的黑素细胞肿瘤的转基因斑马鱼。单独表达BRAFV600E的转基因动物发生良性黑素细胞增生，表现为较宽、较深的条纹；而单独表达HRASG12V导致恶性黑素细胞瘤，最初在表皮水平扩张，皮下包裹全身，而非腹侧表面（径向生长期或RGP），然后垂直浸润皮下组织（垂直生长期或VGP），主要导致肿瘤结节抬高(图1a)。同时，VGP肿瘤模型的差异表达基因（DEG）数量最多，总计4429个（图1B）。
层次聚类分析DEGs表明，RGP和VGP谱之间的关系比任何其他的双向比较都更接近（图1C）。但deg在RGP和VGP之间是共同的，显示出了潜在进展（图1D）。利用BioBDnet和BioMart将DEGs转化为人类同源物，然后进行生物过程中的氧化石墨烯富集分析。结果显示，代谢物的变化与19%的上调基因相关，其中脂质代谢基因占28%（图1e）。
图1 | 转录组分析恶性黑素细胞瘤相关的基因特征
2.PET、空间代谢组分析黑素细胞肿瘤清除外源性游离脂肪酸
为了探究斑马鱼体内组织游离脂肪酸的摄取，作者首先使用了[ 18F]-FTHA（一种放射性标记的棕榈酸类似物）作为PET示踪剂进行成像分析。对野生型鱼在给药2小时后进行PET扫描，结果显示[18F]-FTHA主要是在前腹部积累（图2A）。然而，由于空间分辨率比较有限，仅通过PET扫描很难确定[ 18F]-FTHA被占用的位置。因此，作者在PET扫描后进行DESI-MS空间代谢组成像分析，利用其高空间分辨率来确定更精确的示踪剂位置。对野生型斑马鱼进行DESI-MS成像显示，FTHA主要积累在肝脏中（图2B），膳食中的脂肪酸转化为甘油三酯，并入脂蛋白，在体内分布。接下来，对V12RAS转基因斑马鱼进行PET扫描，发现8/8个肿瘤中[18F]-FTHA的浓度（图2c和D），这与转录组学预测的V12RAS转化的黑素细胞中脂肪酸摄取升高相一致。
图2 | 野生型斑马鱼和斑马鱼携带黑色素瘤肿瘤的（[18F]）-FTHA的PET和DESI-MS成像
3.验证研究：甘油磷脂代谢在恶性肿瘤中解除控制
对野生型皮肤、含RGP黑色素瘤皮肤和VGP肿瘤结节进行LC-MS代谢组学研究，以确定黑素细胞肿瘤进展过程中代谢物浓度的变化。与野生型皮肤相比，所有脂质代谢类的一些物种发生了大量变化，随着疾病进展而增加。运用代谢组学检测到的代谢物PCA显示野生型、RGP和VGP样品之间有明显的分离，负离子模式数据的分离更明显（图3A）。整合转录组和代谢组数据分析，突出了VGP（图3B）和RGP样品中的甘油磷脂代谢途径。采用DESI-MS空间质谱成像方法观察VGP黑色素瘤中的磷脂种类，同样显示了肿瘤和健康组织之间的甘油磷脂丰度的明显差异，并且显示了甘油磷脂种类的异质性，包括肿瘤中的PE种类(图3c和D)。
图3 | 甘油-磷脂代谢的改变伴随着黑素细胞肿瘤的进展
4.LPL是一个潜在的治疗靶点
为了评估在人类黑色素瘤中清除脂肪酸的潜力，作者通过逆转录偶联RT-PCR在已建立的人类黑色素瘤细胞系中定量LPL、CD36、FABP7、FATP1和FATP2 mRNA的表达，并将其与NHMs的水平进行对比。研究发现：与NHM相比，所有黑色素瘤细胞系，包括NRAS和BRAF突变体、LPL转录均发生广泛的倍数变化（图4A）。此外，IHC染色阳性显示LPL在90%或更多的原发性和转移性黑色素瘤中表达（图4B）。在77%的痣中也检测到LPL，但主要局限于占据表皮和真皮交界处的痣细胞巢中（图4C）。
图4 | LPL在人黑色素瘤细胞系和肿瘤中的表达
通过在胚胎中色素沉着几乎完全恢复的动物中跟踪肿瘤结节的形成，作者发现所有被色素拯救的动物都出现了亲本V12RAS系特有的RGP外观（图5A）。然而，与mCherry、CCND1相比，LPL的共表达加速了肿瘤结节的形成（图5B）。此外，与mCherry或CCND1相比，LPL的共表达增加了肿瘤的生长速率（图5C）。对于人类黑色素瘤细胞，使用两种独立的siRNA寡核苷酸敲除，LPL可在WM852细胞中减少70%，在WM266-4细胞中降低50%，但没有影响A375细胞（图5D）。
为了解决黑色素瘤细胞中抑制LPL的敏感性的差异，作者通过逆转录偶联RT-PCR和蛋白印迹分析评估了从头脂肪酸合成所需的FASN的表达。A375细胞和WM266-4细胞中FASN的mRNA和蛋白水平显著高于原代黑素细胞，但也显著高于WM852细胞(图5e)，这意味着从头脂肪酸合成可能补充A375和WM266-4细胞的脂肪酸清除，而不是WM852细胞。WM852细胞对LPL的一种小分子抑制剂比A375细胞或WM266-4细胞都要多（图5F）。同时，FASN抑制剂C75（42）和LPL抑制剂联合作用可协同抑制A375细胞和WM266-4细胞的生长，而不抑制WM852细胞的生长（图5F）。
此外，FASN在WM1361细胞中表达相对较低，而在WM35细胞中表达相对较高(图5e）。与上述预测一致，WM1361细胞对LPL抑制剂敏感，而没有添加FASN抑制剂的作用，WM35对LPL抑制剂的敏感性较低，但通过添加FASN抑制剂可致敏（图5F）。
图5 | LPL有助于黑色素瘤细胞的生长
研究讨论
斑马鱼V12ras驱动的黑素细胞肿瘤的脂质代谢发生了实质性的变化。
多模态成像结合脂质组和转录组分析显示，斑马鱼V12ras驱动的黑素细胞肿瘤清除游离脂肪酸，并上调某些甘油磷脂的产生。
斑马鱼黑素细胞肿瘤模型和人类黑素瘤中改变的脂质代谢基因之间的一些重叠，支持了研究中斑马鱼模型的临床前意义。
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本文研究中结合正电子发射断层扫描、解吸电喷雾电离质谱的空间代谢组、代谢组学和转录组学等分析方法，发现了脂肪酸获取可能作为黑色素瘤的一个治疗靶点，该方法开发对监测脂肪酸摄取具有诊断、患者分层和监测药理学反应的潜力，为后续黑色素瘤的治疗提供新思路。
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