2023年11月8日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队和上海师范大学王文琴团队在Nature Communications在线发表题为“Spatial transcriptomics uncover sucrose post-phloem transport during maize kernel development”的研究文章。该研究率先利用空间转录组方法详细划分了玉米籽粒灌浆期不同细胞功能亚群，揭示了光合同化产物从进入籽粒到合成淀粉、蛋白和脂类等储藏物质过程的空间转录特征。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
发表时间：2023年11月
材料：灌浆期玉米籽粒
方法：10x Visium空间转录组
玉米是全世界种植最广泛且最高产的作物之一，年平均产量高达10亿吨。玉米籽粒是一个高度复杂的系统，由多达数百万个细胞组成，包括来自母体的二倍体种皮，子代基因型的三倍体胚乳以及二倍体的胚组成。研究籽粒发育的细胞分型和功能分区，对深入解析玉米籽粒时空特异表达基因的分子机制具有重要推动作用，充分利用种质资源包括各种自交系和野生玉米的优良基因。但是，目前依赖于肉眼可见的组织形态学或者显微镜下的细胞学无法分辨形态上极其相似而功能不同的细胞亚群。尤其是与盾片相邻的胚乳区(endosperm adjacent to scutellum，EAS)，该细胞亚群紧挨盾片，是胚乳和胚交流的重要界面，但与周围组织细胞形态高度相似，导致这些区域的细胞亚群难以分辨，它们介导的胚和胚乳信号传导，物质运输和其它生物学功能一直缺乏直接证据。因此，我们迫切需要新技术来区分玉米籽粒中组织细胞的异质性，同时准确分辨“难以分群却功能重要”的细胞亚群，解析灌浆期电子原位杂交图谱构建及基因功能分析，对玉米籽粒的改良有着重要意义。
该研究对玉米籽粒灌浆期进行了显微切片和空间转录组学研究，实现了高通量可视化所有基因的电子原位杂交图谱，鉴定了11个细胞群和332个分子标记基因，绘制了玉米籽粒的“准单细胞水平的电子原位杂交图谱”。此外，该研究还系统构建了籽粒灌浆时各个组织功能区发生的关键事件（信号传导，营养运输，蛋白、淀粉、脂类合成和存储等）和全局基因网络调控图，全面挖掘知之甚少的在信号传导和营养运输上发挥重要作用的关键基因，通过探索它们的生物学功能，为提升玉米产量和品质提供新的基因资源。
1.玉米胚乳发育过程中的籽粒大小与细胞膨胀
研究人员选择玉米自交系W64A进行空间转录组学研究。为了准确评估籽粒大小，储存积累和细胞扩增的样本阶段，研究人员在10、14和18 DAP下对W64A自交系进行了切片。分析表明DAP为10-24时，内核部分的大小小于4×8 mm。胚乳细胞在10 DAP后停止增殖并开始合成代谢物。此时确定籽粒中细胞的命运，包括果皮、糊粉层（AL）、胚乳、基底胚乳转移层（BETL）和其他组织器。值得一提的是，空间转录组芯片上的捕获区域是一个边长为6.5mm的正方形，可以容纳对角放置的玉米粒，从而使全粒切片上的基因表达易于观察，并使玉米粒成为研究具有完整组织切片的空间转录组学的理想材料。其次，该芯片包含5000个包含阵列寡核苷酸条形码的spot，不仅用于mRNA捕获，还用于标注空间信息。玉米籽粒中的组织细胞例如胚胎和胚乳，大小不等。淀粉胚乳细胞在10 DAP时的平均大小为50um，在14 DAP时为60um，而胚细胞大小在10至30um之间。10x Genomics Visium芯片上的spot直径为55um，单个spot可以覆盖多个细胞。研究人员对代表早期、中期和晚期阶段的12DAP、18DAP（两个生物重复）和24DAP的阶段进行了空间转录组学研究。后续将其命名为S12D、S18D_1、S18D_2、S24D。
2. 空间转录组揭示了灌浆阶段的异质性和功能分区
在进行空间转录组测序之前，研究人员对从12、18和24 DAP中取样的籽粒进行包埋、固定、切片和HE染色。结果显示盾片呈灰色，胚胎分生组织（EM）呈蓝色，表明细胞分裂活跃。连接子组织和母体组织的基底胚乳转移层和糊粉层的界面显示为紫色。用淀粉颗粒填充的淀粉胚乳细胞不能染色，导致暗灰色，而BETL旁边的传导区为亮灰色（图1a）。
研究人员使用10x Genomics Visium平台进行测序。利用唯一分子标识符（UMI）将RNA分子的数量映射到样品切片上。研究结果表明，缺失的组织对应淀粉区域，其特征是淀粉浓度高。该区域由深蓝色表示，表明基因表达水平低。研究人员检测到每个spot平均有10,901-12,257个UMI和3573-3912个表达基因，其中胚胎和糊粉层spot贡献了最多的基因和UMI。
根据基因表达相似性使用降维技术确定了25个空间cluster（图1b）。为了验证新细胞类型的存在，为通过空间转录组学分析确定的25个cluster筛选了一套标记基因。结合切片和HE染色图像中的解剖信息，研究人员将这些cluster注释为11个功能细胞群（图1c）。在这种情况下，“细胞群”也被称为“隔室”，代表具有相似基因表达模式和物理接近性的细胞群，表明它们具有相似的功能，包括1）两个母源区域：PC和PE；2）两个胚胎区域：盾片和胚胎分生组织；3）七个胚乳细胞群：胚乳基底转移层、传导区、EAS、SE、VE、糊粉层和胚胎周围区域（ESR）。母源组织和子代组织之间的BETL、EAS以及母源和胚乳之间的AL这三个界面被准确定位。此外，对应于c24的ESR仅在12 DAP时出现，在18和24 DAP时消失（图1c）。空间转录组学能够同时识别整个玉米基因组中约40,000个基因的RNA原位表达数据。这种高通量能力提高了发现新细胞类型的灵敏度。研究人员发现种皮包含三种不同的细胞类型，胚胎可分为五类，淀粉胚乳可分为五类，玻璃质胚乳可进一步分为五类。
图1 三个灌浆阶段的时空分析
为了构建基因共表达网络，研究人员通过排除在不同细胞类型中代表噪音的低表达水平（UMI作者通过相关性分析发现，单个模块与11个相应的解剖区域密切相关。模块的GO功能注释在某些生物过程中得到了丰富，包括碳水化合物运输、淀粉生物合成过程、脂肪酸生物合成过程、营养库活性等，这与发育中的籽粒灌浆阶段一致。
证据表明，mRNA群体中重叠程度最高的细胞群预计将更紧密相关，并可能共享功能。Pearson相关性的分层聚类显示，附近解剖组织的隔室密切相关，其中显示了三个大的功能区域：（1）储存积累（胚乳-AL、胚乳-SE、胚乳-VE、胚乳-CZ、胚乳-EAS和母体-PE）；（2）后代发育（胚胎-SCU和胚胎-EM）；（3）母子界面（胚乳-ESR、胚乳-BETL和母体-PC）。研究人员发现母体-PE更接近胚乳细胞群而母体-PC与胚乳-BETL表现出更强的相关性。这表明，尽管母体和子代组织的遗传起源不同，但它们中的基因表达程序是协同作用的。
3. 挖掘蔗糖运输和储存积累的关键基因
GO分析表明，胚乳-SE、胚乳-VE和胚胎-SCU分别显示碳水化合物生物合成过程、营养库活动和脂肪酸代谢过程（图1d,f）。研究人员进一步选择了332个基因作为标记基因，这些基因在WGNCA分析中具有显著的基因-基因连接特征（图1e）。研究人员使用组织切片上的空间转录组数据对这些基因进行了可视化处理（图2）。此前研究例如糊粉层中的AL9（Zm00001d012572）、胚乳-BETL中的CWIN2（Zm00001d003776）、胚乳-EAS中的SWEET14a（Zm00001d007365）、胚胎-SCU中的ACCase（Zm00001d004125），在相应的细胞类型中显示出高度特异的mRNA定位模式。这些数据表明，空间转录组数据准确地反映了籽粒中内源性mRNA的定位。此外，标记基因清晰地显示了细胞异质性，例如在胚乳-BETL中编码钾转运蛋白的Zm00001d036784、在胚乳-CZ中编码山梨醇脱氢酶的Zm00001d031727、在胚乳-EAS中编码磷酸转运蛋白的Zm00001d018445、在胚乳-ESR中编码角蛋白的Zm00001d011340。Zm00001d002952编码胚胎SCU中的水通道蛋白等。这些鉴定的标记基因将有助于揭示特定细胞群的新功能。为了验证鉴定的标记基因，研究人员利用激光捕获显微切割（LCM）的结果进行了比较，观察到一致的重叠，表明了本研究方法的准确性和可靠性。此外，研究人员随机选择了12个确定的标记基因，使用RNA原位杂交验证mRNA分布（图2），它们在相应的细胞器中显示了特异性的表达信号，与空间转录组数据一致（图2）。相反，虽然一些RNA原位杂交由于实验中过度染色或非特异性杂交导致的噪声背景而表现出不清晰的信号，但由空间转录组学创建的电子RNA原位杂交图谱更特异和清晰（图2）。
图2 使用实验和电子RNA原位杂交验证标记基因
研究人员发现一些基因家族中的许多成员倾向于在特定的细胞器中表达，如母体PC中的MAD（12个成员），胚胎SCU中的油质蛋白（8个成员），胚乳VE中的玉米醇溶蛋白（21个成员）和胚胎中的球蛋白（3个成员），表明它们在籽粒发育和灌浆中具有特定功能。来自bHLH、MYB和GRAS家族的一些转录因子被鉴定为标记基因，表明它们在籽粒发育中起着关键作用。然而，它们在调节籽粒发育中的生物学功能仍然需要进一步的实验验证。
4.玉米籽粒中储存代谢合成相关转录物的空间分布差异
玉米胚乳由玻璃质胚乳和淀粉胚乳组成（图3a）。玉米籽粒质地受玉米粒周边玻璃质胚乳与中心淀粉胚乳的比例影响。玻璃质胚乳使玉米粒更坚硬，保护玉米粒在收获、运输和储存过程中免受机械损伤，而淀粉胚乳易碎，易受病虫害影响。许多因素影响玻璃质胚乳的形成，其中淀粉和玉米醇溶蛋白的合成在这一过程中起着至关重要的作用。在玉米粒灌浆过程中，玉米粒细胞质中的蛋白质体包围着淀粉粒。然而，胚乳外围的淀粉粒比中心少且小，而蛋白质体的数量和大小在这两个区域中则相反。在种子成熟过程中这些成分的凝结导致外层形成玻璃质胚乳，而内层形成柔软的淀粉胚乳（图3b）。然而，这两个区域中玉米醇溶蛋白和淀粉的不同合成机制尚不清楚。我们发现许多编码淀粉合成酶的基因，包括蔗糖合酶（SH1）、葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶大亚基和小亚基（SH2和BT2）、腺苷酸转运蛋白（BT1）、淀粉合酶（SS1和SS2）、淀粉脱支酶（DBE1）和糖基化2（SU2）作为胚乳-SE区域的标记基因，这与胚乳-SE位于玉米粒中心部分相一致（图3a）。我们还发现，21个玉米醇溶蛋白成员被列为胚乳VE中表达量最高的基因，包括15-kD β-玉米醇溶蛋白、16-kDγ-玉米醇溶蛋白、27-kDγ-玉米醇溶蛋白、19-kD和22-kDα-玉米醇溶蛋白。18-kD δ-玉米醇溶蛋白是W64A自交系中的突变基因，但其在胚乳-AL和胚乳-VE中也被检测到。50-kD γ-玉米醇溶蛋白在胚乳-SE和胚乳-VE中都高度表达。玉米醇溶蛋白基因在胚乳中的空间差异表达验证了玻璃质胚乳在外围区域形成的事实。
图3 玉米种子淀粉、蛋白质和油脂的空间特异性积累
玉米种子中的大部分油和脂质都积聚在胚胎中（图3e）。研究人员发现，脂肪酸生物合成中由乙酰辅酶A羧化酶组成的底物活化、酰基载体蛋白（ACP）组成的延长、脂肪酸脱饱和酶组成的脱饱和的几个关键酶的编码基因在胚胎-SCU中高度表达，与作为油储存器官的胚胎相吻合（图1f）。、一些参与脂质生物合成的基因在胚胎-SCU中高度表达，如编码油质蛋白的Zm00001d045988、Zm00001d002768和Zm00001d033612，以及编码油体相关蛋白的Zm00001d043464、Zm00001d051459和Zm00001d011755（图1f和3f）。这些结果与玉米种子中油和脂质的空间特异性积累相一致。
5. 蔗糖转运蛋白基因的功能验证
在籽粒灌浆过程中，目前研究普遍认为蔗糖是从源组织运输到库组织的。在韧皮部区域卸载后，蔗糖要么被细胞壁转化酶分解成果糖和葡萄糖，被单糖转运蛋白吸收，要么被蔗糖转运蛋白（SUTs）直接回收，用于营养输送。先前的研究表明，SUTs在玉米叶片的蔗糖韧皮部装载中起着关键作用26。然而，由于缺乏对其空间表达和定位的了解，SUTs在韧皮部后运输的无细胞质步骤中的确切作用仍然未知。
研究人员发现玉米基因组中有七个编码蔗糖转运蛋白的基因，包括ZmSUT1（Zm00001d027854）、ZmSUT2（Zm00001d041192）、ZmSUT3（Zm00001d033011）、ZmSUT4（Zm00001d018527）、ZmSUT5（Zm00001d016938）和ZmSUT6（Zm00001d050873）和ZmSUT7（Zm00001d048311）。ZmSUT1和ZmSUT7在蛋白质序列和cDNA编码序列中的同一性分别为93%和91%，表明它们来自最近的重复（图S14和S15）。qRT-PCR显示ZmSUT1、ZmSUT2、ZmSUT4、ZmSUT5和ZmSUT7在玉米种子中表达水平不同（图S16和表S8）。我们的空间转录组数据显示，只有ZmSUT1和ZmSUT7在BETL中特异性表达，表明这两个重复拷贝在空间调控中是保守的（图4a），而ZmSUT2、ZmSUT4和ZmSUT5在玉米种子中没有特定的空间模式。
图4 玉米籽粒ZmSUT基因的功能研究
为了验证ZmSUT1和ZmSUT7在籽粒灌浆中的作用，我们通过RNA干扰（RNAi）驱动BETL特异基因（Betl9）启动子特异性抑制ZmSUT1和ZmSUT7的表达，并恢复两个独立的RNAi转基因系。研究人员发现，zmsut1/7RNAi种子BETL区域的细胞壁向内生长（CWI）明显受到抑制，表明ZmSUT1和ZmSUT7对CWI的形成至关重要（图4b）。与对照组相比，自交系zmsut1/7RNAi转基因系的粒径和重量大大降低（图4d，e）。为了排除zmsut1/7RNAi对植物生长的可能影响，进而影响种子发育和籽粒灌浆，我们使用zmsut1/7RNAi花粉对野生型穗进行授粉，发现由此产生的子粒粒径和重量也显著降低（图4c-e），证实ZmSUT1和ZmSUT7对玉米籽粒灌浆至关重要。因此，BETL区域ZmSUT1/7基因中的突变不仅影响该特定区域的表型，还会由于营养运输中断导致籽粒整体表型出现问题。
本研究第一个重点解决的问题是拟解析玉米籽粒灌浆早中晚期的空间转录组，绘制真正的“玉米籽粒电子原位杂交图谱”和构建“分子细胞学”。本研究第二个重点解决的问题就是构建籽粒灌浆时各个组织功能区发生的关键事件（信号传导，营养运输，蛋白、淀粉、脂类合成和存储等）和全局基因网络调控图，全面挖掘EAS以及母体组织和胚乳连接区域（PC）的特异表达基因。在这些工作的基础上，本项目第三个重点解决的问题就是筛选EAS和PC区在信号传导和营养运输上发挥重要作用的关键基因，通过探索它们的生物学功能，为提升玉米产量和品质提供新的基因资源。
参考文献
1.Fu Y, Xiao W, Tian L, Guo L, Ma G, Ji C, Huang Y, Wang H, Wu X, Yang T, Wang J, Wang J, Wu Y, Wang W. Spatial transcriptomics uncover sucrose post-phloem transport during maize kernel development. Nat Commun. 2023 Nov 8;14(1):7191. doi: 10.1038/s41467-023-43006-7. PMID: 37938556.
