Introduction
越来越多的证据表明，肠道菌群与人类健康密切相关。肠道菌群有超过1000多种，可分为共生细菌、致病菌和机会性细菌。这些细菌以一定的比例和数量维持机体肠道生态系统的稳态平衡。然而，肠道菌群的组成和多样性并不是恒定的，受到饮食、生活方式和抗生素滥用等多种因素的影响。肠道菌群与宿主之间的微生态失调可能导致肥胖、高血糖、心血管等疾病。
流行病学研究也已经证实，肠道菌群的变化可能会对2型糖尿病（T2DM）的发病产生重大影响。有证据显示，2型糖尿病的拥有属性是肠道菌群的丰度和多样性降低。因此，通过调节肠道菌群逐渐成为一种预防和治疗T2DM的方法。而膳食干预是影响肠道菌群结构和功能的重要途径之一，为维持肠道菌群的稳态从而防治T2DM提供了可能。例如，有研究报道可溶性膳食纤维和四氢姜黄素可以通过促进厚壁菌门、乳杆菌门和普雷沃氏菌门的增殖，同时减少拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和瘤胃球菌科的丰度，从而改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。非消化性低聚糖（NDOs）由非α-1,4-糖苷键连接的单糖组成，不能被人体消化道降解而直接进入大肠，通过作为肠道益生菌增殖和产生短链脂肪酸（SCFAs）的能量来源来并抑制有害细菌的生长而发挥健康益处，包括抑制食欲、免疫调节、抗炎和降血糖。
在本研究中，广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所胡腾根博士、邹宇晓研究员等通过生物酶解桑叶多糖制备得到一种非消化性低聚糖（MLO 2-1），通过NMR分析对其结构进行了解析，并进一步通过体外粪菌发酵研究了其对T2DM肠道菌群的影响，通过LEFSe及Spearman分析MLO2-1可能特异性影响的肠道菌株，并通过动物实验验证了特异性菌株降血糖活性及其代谢利用MLO2-1的途径。
图1 研究思路图
Results
通过体外消化实验证明MLO2-1能耐受唾液、胃和小肠消化液的降解，运用甲基化及NMR手段解析了MLO2-1的糖链结构为：α-T-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→5)-α-Araf-(1→5)-α-Araf-(1→5)-α-Araf-(1→3)-α-(6-OAc)-Glcp-1，主要由非α-1,4糖苷键组成，也进一步证实了体外消化实验的结果。
图2 体外消化实验结果
图3 NMR分析结果
上述研究结果表明，MLO2-1能顺利通过消化道到达大肠被肠道菌群利用从而发挥作用。那MLO2-1是怎么被肠道菌群代谢利用的呢？通过Tax4Fun分析发现，MLO2-1主要通过上调肠道菌群中果糖二磷酸醛缩酶（FBA）、磷酸甘油醛脱氢酶（GPD）、烯醇化酶（EA）、阿拉伯糖异构酶（AraA）、核酮糖激酶（AraB）、丙酮酸脱氢酶（PD）、乙酸-CoA连接酶（ACL）、丙烯酰-CoA还原酶（ACR）、苹果酸脱氢酶（MD）、甲基丙二酰-CoA变位酶（MCM）、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（HBCD）、烯酰-CoA水合酶（ECH）、磷酸丁酰转移酶（PBT）、丁酸激酶（BK）和乙酸辅酶 A 转移酶（ACT）的表达，抑制磷酸果糖激酶（PFK）和酮糖转移酶（TK）的活性，从而促进肠道菌群对MLO2-1的利用，并代谢生产乙酸、丁酸及丙酸。
图4 肠道菌群对MLO2-1的代谢途径
进一步分析了MLO2-1对肠道菌群的影响，结果发现，MLO2-1能显著上调Aerococcus urinaeequi、L. murinus、Candidatus Sacchaimonas和uncultured bacterium gTuricibacter的丰度，抑制Klebsiella variicola、Escherichia Shigella、unclassified g Enterobacter、Morganella morganii、Bacteroides uniformis、unclassified f Enterobacteriaceae、unclassified o Enterobacterales、Parabacteroides distasonis、Bacteroidessartorii和Bacteroides intestinalisDSM 17393的增殖。并通过相关性分析发现，MLO2-1显著影响的肠道菌群中，只有L. murinus与其他菌群都存在显著相关性，推测MLO2-1可能通过调控L. murinus进而影响其他菌群发挥降血糖活性。
图5 MLO2-1对T2DM肠道菌群的影响
通过动物实验验证了L. murinus及MLO2-1的降血糖活性，并观察了以MLO2-1为唯一碳源L. murinus的生长情况，发现L. murinus能上调araA、araD、tk、ta、gk、pfk、pk、ldh、pat、ak、pd、od、md、mcd、hbcd、ech、pbt和bk的表达，促进其对MLO2-1的利用，并代谢产生短链脂肪酸，上述结果证实了MLO2-1可能通过调控L. murinus进而影响其他菌群发挥降血糖活性。
图6 MLO2-1和
图7
Conclusion
本研究分离纯化一种非消化性低聚糖MLO2-1，其结构为α-T-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→5)-α-Araf-(1→5)-α-Araf-(1→5)-α-Araf-(1→3)-α-(6-OAc)-Glcp-1。体外消化实验证实其能耐受消化液的降解，顺利通过上消化道到达大肠，并通过调控肠道菌群发挥降血糖活性，其具体机制为MLO2-1被肠道菌群分泌的果糖二磷酸醛缩酶（FBA）等酶的作用下降解代谢成短链脂肪酸，进而影响肠道菌群的组成特别是促进L. murinus的增殖。
01
第一作者
胡腾根，男，工学博士，现为广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所助理研究员，主要研究方向为果蔬中活性物质互作及稳态化研究；多糖及低聚糖改善免疫力及调控糖脂代谢活性作用机制研究。目前主持广东省、广州市基金等项目6项，参与国家自然科学基金、广东省重点研发等多项项目，在国内外期刊公开发表学术论文60余篇，其中SCI收录40篇，第一、共一或通信作者论文16篇，授权国家发明专利6件。
02
通信作者
邹宇晓，女，研究员，现为广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所副所长，主要研究方向为蚕桑资源和岭南特色果蔬的营养、生物活性物质及其功能评价的工作。先后主持国家和省部级以上相关课题10项；获各级成果奖9项，其中省部级科技进步一等奖4项、二等奖3项和三等奖2项；参编论著5部，发表论文300余篇。获国家授权发明专利70余件（第一发明人13件）。
Structural elucidation of mulberry leaf oligosaccharide and its selective promotion of gut microbiota to alleviate type 2 diabetes mellitus
Tenggen Hu
a,b,c
, Yuanshan Yu
a,b
, Jijun Wu
a
, Yujuan Xu
a
, Gengsheng Xiao
d
, Kejing An
a
, Erna Li
a
, Sentai Liao
a
, Yuxiao Zou
a,*
a
b
c
d
*Corresponding author.
Abstract
Two oligosaccharide fractions (MLO 2-1 and 2-2) were purified from enzymatic hydrolysate of mulberry leaf polysaccharide. The results of simulated digestion showed that MLO 2-2 was a digestible oligosaccharide, which could be degraded by human digestive juice; while MLO 2-1 possessed the non-digestible property in the upper gastrointestinal tract and performed the function by regulating the gut microbiota. Hence, MLO 2-1 was selected for the further analysis. The structure of MLO 2-1 was elucidated as follow:α-T-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→5)-α-Araf-(1→5)-α-Araf-1→5)-α-Araf-(1→3)-α-(2-OAc)-Glcp-1. Thein vitrofecal fermentation results showed that MLO 2-1 could modulate the composition of gut microbiota. Meanwhile, MLO 2-1 was effectively metabolized by fecal bacteria to produce lactate and short chain fatty acids, especially acetate and butyrate. The specific metabolic pathways of MLO 2-1 by gut microbiota were further illuminated. Gut microbiota analysis revealed that MLO 2-1 selectively promoted the growth ofLigilactobacillus murinus, a commensal bacterium presented a reduced level in T2DM mice. Animal experiments indicated that MLO 2-1 andL. murinusexhibited hypoglycemic activities. These results demonstrated that MLO 2-1 might alleviate T2DM by selectively accelerating the proliferation ofL. murinus.
Reference:
HU T G, YU Y S, WU J J, et al. Structural elucidation of mulberry leaf oligosaccharide and its selective promotion of gut microbiota to alleviate type 2 diabetes mellitus[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2161-2173. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250180.
