顶刊《Cell》 第 187 卷第 10 期，收录了一篇名为《Tracing the origin of alveolar stem cells in lung repair and regeneration》的研究论文，该文为国科大杭高院周斌课题组的最新研究成果。（图1）
研究团队引入了一种双重组酶介导的交叉遗传谱系追踪方法，能够在肺稳态、损伤和修复过程中精确研究2型肺泡（AT2）细胞的起源。发现 1 型肺泡 （AT1） 细胞处于终末分化状态，在肺损伤和修复后不向AT2细胞分化。Club细胞、细支气管肺泡干细胞(BASCs)和现有的AT2细胞的特异性同步标记揭示了它们在损伤后对AT2细胞的确切贡献。
在机制上讲，Notch信号的抑制可以促进BASCs的分化，但与之相反的是损害了Club细胞在肺修复过程中产生AT2细胞的能力。这种交叉遗传谱系追踪策略具有更高的精度，能够阐明各种类型上皮细胞在损伤后肺泡再生中的生理作用。（图2）
一、数据重现与推翻
先前的研究报道，Hopx AT1细胞可以在肺损伤后去分化为AT2细胞。研究人员使用肺切除术 （PNX） 和博来霉素诱导损伤成年Hopx-CreER;R26-tdT小鼠，通过免疫染色，发现与假手术组相比，Hopx细胞对受损肺泡区域的部分AT2细胞有显著贡献，该观察结果与此前报道一致。
但检查了初始标记图谱发现，Hopx 不仅是 AT1 细胞的标志物，还在其他类型的上皮细胞中表达，基于 Hopx 的遗传工具异位标记了 BASCs、Club细胞和 AT2 细胞的一个子集，Hopx-CreER并非是针对分化前后AT1细胞的特异性遗传工具。（图3）
随后，研究人员换用不同基因的Hopx-2A-DreER和Ager-CreER小鼠品系，分别证明基于Hopx和Ager的遗传工具对追踪AT1细胞没有特异性。由此无法评估AT1 细胞在肺修复和肿瘤进展过程中的确切发展。（图4）
二、开发方法追踪AT1细胞
虽然基于 Ager 和 Hopx 的遗传工具不会对 AT1 细胞特异性标记，但它们对肺上皮细胞的异位标记几乎是相互排斥的。研究人员因此开发了基于以上两种基因的双重组酶介导的交叉遗传谱系追踪方法，免疫染色显示，使用该策略标记AT1细胞具有高度特异性。（图5）
有了合适的标记方法，研究人员检查了肺损伤后AT1细胞的可塑性。分别进行了PNX 、博来霉素以及高氧诱导损伤，数据表明，HopxAger AT1 细胞是终末分化的细胞，不能在肺损伤部位去分化为 AT2 细胞。（图6）
三、开发方法并探索AT1细胞的可塑性
鉴于上述的交叉标记策略仅标记了HopxAger AT1 细胞的亚群，研究人员随后采用了另一种双重组酶响应报告基因，即嵌套报告基因 2 （R26-NR2）。在此策略中，所有的潜在Hopx+AT1细胞群会被特异性标记，而阻断不必要的Club细胞、纤毛细胞、BASCs及AT2细胞的标记。（图7）
然而结合PNX诱导和博来霉素诱导的肺损伤模型，研究人员仍然未检测到AT1细胞转分化为AT2细胞的标志。通过以上两种双同源重组谱系示踪新技术，研究人员表明，在肺泡损伤后，AT1细胞高度特化，无法去分化为AT2细胞。（图8）
四、开发方法追踪Club细胞和 BASCs
研究人员猜测AT2 细胞可能来自其他异位标记细胞，例如Club细胞和 BASCs 。为了区分Club细胞、BASCs和AT2细胞的标记，研究人员使用了另一种交叉报告基因 R26-TLR，生成了Scgb1a1- creer、Sftpc- dreer、R26-TLR三阳性小鼠，其中Scgb1a1+Club细胞用tdT (Club示踪剂)标记，Sftpc+ AT2细胞用ZsG (AT2示踪剂)标记，Scgb1a1+ Sftpc+ BASCs用tdT和ZsG (BASC示踪剂)标记。
方法完备后，研究人员开始探讨肺损伤后这些细胞的可塑性。首先进行了PNX损伤，通过免疫染色，发现Club示踪剂对假手术组小鼠的AT2细胞没有贡献，并且在损伤后对细支气管周围区域的AT2细胞贡献很小。同样，BASC 示踪剂在损伤后对细支气管-导管连接处 （BADJ） 周围的 AT2 细胞的贡献很小。大多数 AT2 细胞被 AT2 示踪剂标记，表明AT2 细胞是 PNX 损伤肺中肺泡上皮再生的主要祖细胞。
然后，研究了博来霉素诱导的肺损伤期间这些细胞的可塑性。通过免疫染色，发现与细支气管相邻的很大一部分 AT2 细胞被tdT+ZsG– 或tdT+ZsG+标记，表明这些 AT2 细胞分别来自 Club 示踪剂和 BASC 示踪剂。然后，我们评估了Club细胞的肺泡扩张是否代表修复或细支气管化。免疫染色结果显示，Club示踪剂的大部分肺泡扩张代表肺泡损伤后的修复。
此外，研究人员在 8 个月时收集了肺部样本，以研究长期再生阶段的细胞命运。通过免疫染色，我们发现与4周短期再生时间点相比，来自Club示踪剂和BASC示踪剂的AT2细胞在8月时从细支气管进一步扩增。综上所述，发现Club细胞可以对肺泡损伤做出反应，并通过贡献 AT2 和 AT1 细胞以再生肺泡上皮。（图9）
五、Club细胞在肺损后的贡献程度
通过将BASCs和AT2细胞中的p21过表达与博来霉素诱导的损伤相结合，隔绝AT2 细胞和 BASCs 的再生能力，生成相关肺泡损伤模型，探究Club细胞在肺损后的贡献程度。
损伤后4周，Club细胞贡献的肺泡上皮比例高于非p21策略，表明AT2细胞增殖受损促进Club细胞介导的肺泡修复和再生。
损伤后8个月，检测到大量的tdT细胞，这些细胞扩散到肺部的远端边缘，并在长期修复过程中占据了某些肺叶的整个损伤区域。免疫染色和定量数据表明，Club细胞表现出高度的细胞可塑性，并且具有在博来霉素和p21-OE诱导的损伤部位再生大面积受损肺泡的巨大潜力。（图10）
研究人员随后利用了另一种遗传策略（基于白喉毒素DT的遗传模型）来诱导肺泡损伤，进一步证实了Club细胞产生肺泡的巨大潜力。
六、Club细胞和 BASCs的转化异质性
研究人员对标记分选出的三组细胞（Club细胞、BASCs以及AT2）进行单细胞转录组测序分析（scRNA-seq）。通过UMAP分析，确定了Club示踪剂的7个细胞亚群，每个亚群都有独特的关键标记。拟时序分析揭示这些细胞亚群之间具有紧密的谱系联系，其中club和H2-K1+ club亚群作为起点通过transient亚群分化为AT2。（图11）
对于BASCs到AT2细胞的转换，UMAP分析同样揭示了来自BASC示踪剂的细胞的7个细胞亚群，这些细胞亚群在基因表达谱系上具有连贯性，拟时序分析显示细胞分化谱系起始于BASC-like亚群，然后经过transient依次分化成AT1或AT2。
研究人员还比较了来自 Club-tracer、BASC-tracer 和 AT2-tracer 的谱系标记的 AT2 细胞之间的相关性。发现BASC-tracer中的AT2细胞在基因表达上更接近于AT2-tracer中的AT2细胞。总的来说，数据表明，Club细胞来源的肺泡细胞和BASCs来源的肺泡细胞之间存在相似性和差异性，并且Club细胞和BASCs向AT2细胞的转化涉及两个不同的过程，具有不同的分化程序。（图12）
七、Notch信号的调节
在 Club 示踪剂和 BASC 示踪剂中，Notch 信号转导及其下游关键因子 Hes1 的基因表达水平在 AT2 细胞分化过程中下调，表明Notch 信号转导在过渡中具有潜在的调节作用。
结合博来霉素损伤模型，研究人员发现敲除Notch信号通路后，Club细胞贡献的AT2细胞比例显著性降低，BASCs贡献的AT2细胞比例显著性上升，而过表达Notch则会显著抑制BASCs向AT2细胞的分化。此实验证实Notch通路在Club及BASCs向AT2转分化过程中发挥重要作用，并且属于两种截然相反的调控作用。（图13）
以上实验证明Club细胞可作为AT2细胞的再生起源，并且首次在功能层面上揭示Club细胞与BASCs属于两种不同细胞类型，不仅具有不同基因表达特点，而且在向AT2细胞分化过程中受Notch通路相反的调控。
总之，这项研究提供了更精确的遗传谱系追踪证据，提高了对肺细胞可塑性的理解。交叉遗传谱系追踪结果揭示了肺泡修复过程中AT2细胞的起源和更新机制，为肺再生和潜在的疾病治疗提供了新的见解。此外，本文报道的新策略或可广泛用于研究组织发育、再生和许多其他情况下的疾病中的不同细胞起源和细胞发展。
DOI： https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.010
