小胶质细胞在阿尔茨海默病 (AD) 中发挥着多种病理生理作用，遗传易感因素会影响小胶质细胞功能，从而影响 AD 风险。CD33 是一种免疫调节受体，它通过单核苷酸多态性与 AD 易感性相关，该多态性调节 mRNA 剪接，使蛋白质表达从长蛋白质异构体 (CD33M) 转变为短异构体 (CD33m)。由于小鼠和人类 CD33 的功能差异，了解人类CD33异构体如何对体内小胶质细胞功能产生不同的影响一直具有挑战性。近期，在Molecular Neurodegeneration期刊发表了题为“Alzheimer’s disease associated isoforms of human CD33 distinctively modulate microglial cell responses in 5XFAD mice”的论文,在这里，作者通过研究表达任一人类CD33异构体的转基因小鼠与淀粉样变性的5XFAD小鼠模型杂交来应对这一挑战，发现人类 CD33 异构体对小胶质细胞对淀粉样蛋白-β (Aβ) 沉积的反应具有相反的影响。
与5XFAD对照小鼠相比，表达CD33M的小鼠Aβ水平升高，弥漫性斑块增多，疾病相关小胶质细胞减少，营养不良性神经突增多。相反，CD33m促进斑块压缩和小胶质细胞-斑块接触，并最大限度地减少神经斑块病理，突出了这种亚型对AD的保护作用。与CD33M小鼠中在较晚时间点出现的更具侵袭性的病理相比，由CD33m驱动的保护性表型在较早时间点被检测到，这表明CD33m 在疾病进展的早期阶段对小胶质细胞功能有更显著的影响。除了在调节吞噬作用方面发挥不同的作用外，scRNAseq和蛋白质组学分析表明，CD33m+小胶质细胞在斑块接触部位上调Nestin，这是一种参与细胞迁移的中间纤维。本研究为CD33作为AD的主要遗传易感因素如何调节小胶质细胞功能提供了新的功能见解。
研究背景
晚发型阿尔茨海默病是由遗传因素和环境因素之间复杂的相互作用引起的。全基因组关联研究（GWAS）表明，大约70% 的阿尔茨海默病 (AD) 风险可归因于遗传因素。阐明已识别遗传因素的功能方面可以促进了解导致疾病发病的潜在机制。人类遗传学以及小鼠模型共同指出，大脑中的免疫细胞（称为小胶质细胞）通过多种功能在 AD 发病机制中发挥关键作用，包括其吞噬淀粉样蛋白 β (Aβ) 的能力。在 GWAS 确定的与 AD 风险相关的众多基因中，CD33 基因中的单核苷酸多态性 (SNP) 是排名最高的易感位点之一。事实上，CD33是唯一与载脂蛋白Eε4等位基因联合作用显著的因素，提示CD33与其他主要危险因素结合时对AD易感性的影响可能更为深远。CD33是表达于髓系细胞的免疫调节唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)家族的成员。在大脑中，CD33主要由小胶质细胞表达，其免疫调节作用在AD发病机制中具有重要意义。
CD33 中常见的 AD 相关 SNP rs3865444 位于启动子区，被认为是附近 SNP rs12459419 的功能代理，rs12459419 位于外显子 2 内四个核苷酸处。后者 SNP 调节 mRNA 剪接。常见的CD33等位基因 (rs12459419C) 有利于产生一种称为人CD33M (CD33M；M=主要) 的长蛋白异构体，并且与次要CD33等位基因 (rs12459419T) 相比，与AD易感性增加有关。次要AD保护性CD33 SNP增强了外显子2跳跃，从而导致产生一种称为 CD33m (m=次要) 的短蛋白异构体，这种异构体缺乏糖基结合IgV 结构域。虽然常见等位基因 (rs12459419C) 导致产生约 90% 的 CD33M 和 10% 的 CD33m，但保护性等位基因 (rs12459419T) 使这一比例变为 CD33M为70%，CD33 同工型为 30%。CD33m 最初被认为是通过因 CD33M 表达减少而导致的功能丧失来发挥其保护作用，然而，最近的几项研究表明 CD33m 的功能获得作用可能有助于降低 AD 风险。首先，CD33 的另一种变体 (rs201074739) 是一个无效等位基因，不具有 AD 保护作用。其次，该研究团队提供了证据，支持CD33m在体外小胶质细胞中发挥功能获得作用，最显著的表型是吞噬作用增强。值得一提的是，保护性 CD33 等位基因似乎源自人类，而在小鼠和非人类灵长类动物中不存在。在这方面，研究 CD33 对 AD 的影响的一个重要考虑因素是小鼠 CD33（mCD33）和人类 CD33（hCD33）之间缺乏功能保守性。小鼠和人类的 CD33 有几个根本区别：(i) mCD33 缺乏免疫受体酪氨酸抑制基序；(ii) mCD33 与 Dap12 配对；(iii) mCD33 和 hCD33 有不同的配体；(iv) 小鼠中不会产生短同工型（CD33m）。因此，这些差异要求需要人类特异性系统来研究 CD33 在AD背景下的影响。为了应对这些挑战，并能够在体内研究单个 hCD33 亚型，该研究团队之前生成并报告了两种转基因 (Tg) 小鼠模型，它们在小胶质细胞谱系中表达人类 CD33M 或 CD33m，并证明了两种 hCD33 亚型在体外调节小胶质细胞吞噬作用方面具有相反的作用。此外，还提供了 CD33m 在功能（增强吞噬作用）和转录水平（scRNAseq）上获得功能效应的证据。尽管 hCD33 亚型的表型方面（例如它们对吞噬作用的影响）已在体外得到部分探索，但每种亚型对体内小胶质细胞功能的影响（特别是在 AD 发病机制的背景下）尚未得到研究。
在此，为了阐明 hCD33 的两种 AD 相关蛋白异构体在体内的功能，将 CD33M 和 CD33m 转基因小鼠与淀粉样变性的 5XFAD 模型杂交。使用免疫荧光显微镜 (IF)、转录组学、蛋白质组学和生化分析来检查每种异构体对小胶质细胞反应和 Aβ 诱导发病机制的影响。研究发现 hCD33 异构体以差异方式调节小胶质细胞，并对 Aβ 积累和斑块组成产生相反的影响。表达 CD33M 的小鼠具有更多弥漫性 Aβ 斑块，而表达 CD33m 的小鼠具有更紧凑的斑块表型，并显示斑块相关小胶质细胞数量增加。因此，CD33m 的功能获得作用不仅限于减少有毒 Aβ 聚集体的数量，还增加了具有惰性致密核心的 Aβ 沉积物的数量，这与营养不良性神经突数量的减少密切相关。总体而言，这项研究是阐明人类特异性 CD33 蛋白亚型在小胶质细胞中的体内作用的重要一步，进一步揭示了这种 GWAS 确定的风险因素的功能方面，并有助于确定导致 AD 发病的早期事件。
结果1：人CD33亚型显著改变Aβ斑块负荷
为了研究hCD33异构体对Aβ在体内蓄积的影响，将STOPfx/FX CD33M和STOPfx/FX-CD33MTG小鼠与5XFAD小鼠杂交。先前证实，当这些模型与CX3CR1Cre小鼠杂交时，hCD33亚型在小胶质细胞中的表达与生理相关。在这项研究中，所有实验小鼠都有一个CX3CR1Cre拷贝，以驱动转基因在小胶质细胞谱系中的特异性表达，并出生到4或8个月。研究发现，在缺乏人CD33转基因的5XFAD对照组小鼠中，CD33M或CD33M小鼠与5XFAD小鼠繁殖的CD33M小鼠之间没有任何统计学上的显著差异（图1）。
由于已知在5XFAD模型中累积的Aβ水平存在性别相关性差异，并研究了hCD33亚型对Aβ沉积的性别特异性影响，因此对雄性和雌性小鼠的队列进行了研究。雌性和雄性小鼠的趋势相似，与5XFAD对照组相比，未发现 hCD33组之间的任何性别特异性差异。然而，所有基因型的雌性小鼠都表现出升高的沉积Aβ水平(图2a-d)，这与之前在5XFAD小鼠中的报告一致。没有观察到雄性和雌性小鼠之间在致密性、总IBA1密度和斑块相关小胶质细胞密度(PAM)方面的任何显著差异（图2e-r）。首先用荧光显微镜对抗Aβ抗体染色的冠状半脑切片进行免疫组织化学分析，并量化Aβ沉积面积占整个脑面积的百分比(图1)。在4个月时，5XFAD对照组和CD33M组之间没有显著差异，但CD33M组小鼠的Aβ水平显著低于5XFAD对照组和CD33M组(图1a,b)。与以前在5XFAD模型中观察到的一致，背侧下托显示高Aβ斑块密度。在8个月时，所有队列中沉积的Aβ水平都有显著差异，与其他组相比，CD33M小鼠的Aβ水平更高，而CD33M小鼠的Aβ水平最低(图1c，d)。由于两种hCD33亚型中的任何一种对其他变量没有任何显著的性别驱动影响，继续对合并的性别进行其余的分析。
关于 Aβ 水平，分析了另外两个参数：皮质和海马中 Aβ 沉积水平的区域特异性分析，以及整个大脑中 Aβ 沉积的数量。4个月大时，CD33m 小鼠皮质中的 Aβ 沉积量比 5XFAD 对照和 CD33M 小鼠少，但此时海马中各组之间没有差异。8个月时，皮质中三组之间的 Aβ 沉积有显著差异，而海马体中唯一显著差异是在 CD33M 与 5XFAD 对照和 CD33m 小鼠之间。对 Aβ 沉积物数量的定量分析表明，在4个月时，各组之间没有显著差异。然而，到8个月时，这些差异达到统计学显著性，与 5XFAD 对照小鼠相比，CD33m 小鼠的 Aβ 沉积物总体较少，而 CD33M 小鼠的 Aβ 沉积物较多。
图1. hCD33 亚型对 5XFAD 小鼠中的 Aβ 积累具有相反的影响
结果2：hCD33 亚型的表达显著改变 Aβ 斑块组成
Aβ沉积物呈现出不同的成分，包括致密核心和弥散形态（图 2a）。致密核心斑块主要由纤维状 Aβ 聚集体组成，可通过淀粉样蛋白结合染料（如 Tiofavin S (TioS)）轻松检测。相反，弥散斑块通常含有分散的原纤维和低聚物，用TioS染色较弱，但可以用 Aβ 抗体轻松检测。为了研究 hCD33 亚型对斑块成分的影响，同时用 TioS 和抗 Aβ 抗体对脑切片进行染色。在整个脑切片中，CD33M 小鼠在两个时间点具有 TioS 核心的 Aβ 沉积物数量明显较少（图 2b-e）。出乎意料的是，CD33m 的 TioS+ 沉积百分比在八个月时明显高于其他两组（图 2b-e）。这些发现表明 hCD33 同工型不仅影响Aβ沉积，而且对斑块组成有很强的影响。具体而言，这些观察结果表明 CD33m小鼠的斑块组成向更紧凑的形式转变，这是与AD保护作用相关的同工型。
为了更详细地检查Aβ斑块的成分，在8个月的时间点对背侧下托和皮质进行了定量分析。与对半脑的整体分析一致，观察到与5XFAD对照组和CD33M组相比，CD33M组小鼠沉积的Aβ水平最高。CD33M组小鼠的TiOS水平高于其他两组，但CD33m组小鼠的背侧下丘脑组织中的TiOS水平也高于5XFAD对照组(图4b)。当检查TiO与总沉积Aβ的量的比率时，结果再次指出CD33M促进更紧密的Aβ，而CD33M促进相反的结果。
这些斑块成分的差异促使研究者进一步分析背部下托和皮质中的单个斑块（图 2f）。四个月时，CD33m 小鼠的 Aβ 沉积物比其他组小，而 CD33M 和 5XFAD 对照组没有差异（补充图 4d）。然而，CD33M 的 TioS 核心更大。由于 Aβ 沉积物较小，尽管 TioS 核心的尺寸没有减小，但与 CD33M 和 5XFAD 对照组相比，CD33m 促进了更高的斑块压缩（图 2g）。在8个月时，CD33M 和 CD33m 均对 Aβ 沉积物的大小产生显著影响，CD33M 促进 Aβ簇增大，而 CD33m 促进Aβ簇减小。尽管总体而言 Aβ 沉积物较小，但与 5XFAD 对照组相比，CD33m 促进斑块中 TioS 核心面积增大。关于下托中 Aꞵ 沉积物的总数，与 5XFAD 对照组和 CD33m 组相比，CD33M+ 小鼠的 Aꞵ 沉积物数量最多。两组之间 TioS+ 沉积物数量没有显著差异，然而，CD33m+ 小鼠在此区域的弥散沉积物（TioS−）数量最少。对 TioS 核心球形度的定量分析表明，与其他两组相比，CD33m 的球形度明显最高，而 CD33M 小鼠的 TioS 核心球形度最低。因此，与其他基因型相比，CD33m 促进了最高水平的斑块压实，而 CD33M 与 5XFAD 对照组相比没有显著差异（图2h）。值得注意的是，对于单个沉积物的分析，重点关注 TioS+ 斑块，而背部下托区域的整体斑块压实并没有区分有或没有 TioS 核心的斑块。
为了对 Aβ 沉积物进行进一步的生化分析，从8个月大的 5XFAD 小鼠的速冻半脑中提取了可溶性和不溶性 Aβ，并通过电化学发光法定量 Aβ1-42、Aβ1-38 和 Aβ1-40 水平。三种 Aβ 物种的可溶性水平在基因型之间没有显著差异。然而，与其他两组相比，CD33m 小鼠的不溶性 Aβ1-42 水平明显较低。与 CD33m 和 5XFAD 对照组相比，CD33M 小鼠的不溶性部分中的 Aβ1-38 和 Aβ1-40 水平明显较高。因为 Aβ1-42/Aβ1-40 比率是疾病进展和认知能力下降的指标，测量了不溶性部分中的这一比率，并观察到与其他组相比，CD33M+ 小鼠的 Aβ1-42/Aβ1-40 水平显著降低。并且同事检测可溶性部分中的 Aβ1-42 寡聚体的水平，尽管 CD33M 小鼠的水平有升高趋势，但这种差异并不显著。由于不同形式的 Aβ 聚集体对蛋白酶消化的敏感性不同，评估不溶性部分中 Aβ1-42 对蛋白酶 K (PK) 消化的敏感性。首先进行 PK 滴定，以优化导致不溶性部分中 Aβ 水平最大下降的浓度。因此，选择 20 µg/ml 的 PK 浓度并将其应用于所有基因型的样本，这导致所有组中的 Aβ1-42 水平显着下降（图 2i）。消化后剩余的 Aβ1-42 水平在所有组中没有区别，这可能是由于存在高度压缩的 PK 抗性物质。然而，每组中 Aβ1-42 相对于未消化对照的百分比表明 CD33m 小鼠的 PK 敏感性 Aβ1-42 明显低于其他小鼠（图 2j）。
由于已证实致密斑块具有较高水平的相关 ApoE，对分离的脑匀浆中的总 ApoE 水平进行了量化，并观察到 CD33m 小鼠不溶性部分的 ApoE 水平明显高于 5XFAD 对照组。将每个样品不溶性部分的 ApoE 水平标准化为不溶性 Aβ1-42 水平，CD33m 显示出比 5XFAD 对照组和 CD33M 小鼠最高的 ApoE/Aβ1-42 水平（图 2k）。总之，或结果的组合进一步支持了之前的观察结果，表明 CD33m 的保护作用可以通过降低 Aβ 水平来实现，这与不溶性部分的生化分析和使用 IF 显微镜对半脑切片的总 Aβ 进行量化的结果一致（图 1）。
图2. hCD33 亚型改变 Aβ 斑块组成
结果3：hCD33 亚型调节小胶质细胞对 Aβ 沉积的反应
CD33m 可增加体外小胶质细胞的吞噬作用，而 CD33M 可降低体外小胶质细胞的吞噬作用。作为体内吞噬作用的替代指标， 使用 Iba1 和 CD68 的共染色（作为反应性吞噬小胶质细胞的一般标记）来量化皮质和下托中小胶质细胞内 CD68 面积的数量（图 3a、b）。在八个月时，与 5XFAD 对照和 CD33M 小胶质细胞相比，CD33m+ 小胶质细胞每 FOV 内 CD68 面积的水平明显更高（图 3b）。与抗 Aꞵ 抗体共染色，证实了小胶质细胞中内化的 Aꞵ 与 CD68+ 结构之间的相互作用。还量化了 PAM 中的内化 Aβ水平，并观察到 CD33M 小胶质细胞中内化 Aβ 水平下降，而与 5XFAD 对照小胶质细胞相比，CD33m 小胶质细胞内化 Aβ 水平升高。CD33M和CD33M小胶质细胞内化Aβ水平分别下降和升高，可以解释在Aβ水平，斑块压实和脑斑块负荷。
此外分析下丘脑和皮质中的斑块周围小胶质细胞（也称为 PAM）（图 3c-e）。8 个月时，与其他两组相比，CD33M+ 小鼠皮质和下托中的 PAM 密度降低，而 CD33m 在两个区域的 PAM 数量明显最高（图 3d、e）。4个月时在下托中也观察到了这些差异。这些趋势不是由于对小胶质细胞数量的总体影响，因为 8个月和 4个月时的整体 Iba1 水平显示出相反的趋势，并且与其他组相比，CD33M 小鼠的 Iba1 密度增加。值得注意的是，由于斑块负担较大，Iba1 密度增加可能反映在 CD33M 小鼠中的小胶质增生或炎症反应增加。
由于小胶质细胞通过生化和生物物理机制促进压实， 通过量化Iba1信号覆盖的Tios核心界面的周长来分析小胶质细胞Tios的核心接触部位，该界面被Iba1信号覆盖在下丘脑和皮质中的Tios+沉积中(图3f-h)。观察到CD33m小鼠在8个月时双侧皮质小胶质细胞-斑块界面显著增加(图3g)和下丘脑(图3h)。在4个月的下丘脑内也观察到这些差异。相应地，CD33M小鼠在小胶质细胞-斑块界面上表现出相反的趋势。这些结果揭示了hCD33亚型调节小胶质细胞对Aβ沉积的反应的另一种方式。
CD33m 组中 PAM 数量增加，尽管整体 Iba1 密度较低，这促使对这些影响的起源进行进一步研究。研究者首先通过评估 Ki-67 染色来量化8个月时增殖的 PAM，在下丘脑和皮质中的小胶质细胞内（图 3i）。与 5XFAD 对照相比，CD33M 或 CD33m 的表达对下丘脑中的 Ki-67+ 小胶质细胞没有影响。在皮质中，CD33m+ 小鼠中 Ki67+ 小胶质细胞的比例略高，表明它们比其他组更具增殖性（图 3j）。然而，当标准化为平均 PAM 密度时，与其他组相比，表达 CD33M 的小胶质细胞的 Ki-67+ PAM 相对数量显着增加（图 3k），这与这些小鼠中较高的 Iba1 密度一致。这些结果排除了增强增殖是 CD33m 小鼠中 PAM 数量增加的关键机制，表明其他机制可能在起作用。
图3. HCD33亚型调节小胶质细胞对Aβ的分化反应结果4：与细胞迁移有关的蛋白质在 CD33m+ 小胶质细胞中上调
采用一种无偏倚方法来识别可能导致 CD33m 小鼠中小胶质细胞对 Aβ 斑块反应增强的蛋白质。因此，应用无标记质谱法对8个月大的小鼠的脑匀浆进行整体定量蛋白质组学分析（图 4a）。通过数据独立采集质谱法 (DIA-MS)，在每个生物重复中一致地识别出 6000 多种蛋白质。平均而言，在 CD33M 小鼠中发现 6697 种蛋白质，在 CD33m 小鼠中发现 6727 种蛋白质，在 5XFAD 对照中发现 6732 种蛋白质。所有样本中所有这些蛋白质的丰度均进行了量化并在此处报告。检查差异表达的蛋白质发现与 5XFAD 对照组相比，CD33M 或表达 CD33m 的小胶质细胞的整体蛋白质组存在许多差异。显著增加和显著减少的蛋白质分别定义为倍数变化大于1.5 或小于 0.66，且 p 值≤0.05。CD33M 与 5XFAD 对照的比较表明，CD33M 脑中共有 47 种蛋白质显著增加，而 96 种蛋白质减少。为了进一步研究不同基因型之间的蛋白质组学变化，在非5XFAD对照(Cx3cr1Cre−/+hCD33m−/ -5XFAD−)和非5XFAD CD33m+ (Cx3cr1Cre−/+hCD33m+/ -5XFAD−)小鼠上重复了相同的工作流程(n = 5 /基因型)，并在5XFAD组中发现有显著变化的蛋白的分布。大多数蛋白质在5XFAD组中表现出显著变化的基因，在非5XFAD配对分析中没有表现出任何差异分布。
通过使用三重图关联比较之间的倍数变化来评估群体间蛋白质组学变化的对应性。生成的图表显示了使用 DIA-MS 测量的蛋白质丰度分布及其与小鼠基因型的关联（图 4b）。评估与 CD33m 小鼠增强吞噬作用相关的不同水平的蛋白质，发现在 CD33m 与 5XFAD 对照和 CD33M 与 CD33m 之间的比较中，巢蛋白水平增加（图 4b、c）。巢蛋白是一种与细胞移动/迁移相关的中间体，据报道在特定情况下（包括激活状态）在小胶质细胞中上调。为了排除神经干细胞 (NSC) 导致巢蛋白变化的可能性， 在蛋白质组学数据库中搜索了 NSC 标记物（SOX2、ABCG2、FABP7、NeuroD1、Hes1、Notch1）。仅发现 ABCG2 和 FABP7 处于可检测水平，且基因型之间均无明显差异。用抗巢蛋白抗体对脑切片进行进一步免疫染色分析，清楚地表明8个月时 CD33m 小鼠的小胶质细胞接触点的巢蛋白水平独特地升高（图 4d）。CD33m+小胶质细胞的总巢蛋白信号明显更高（图 4e）。这些结果进一步支持了 之前的观察结果，即 CD33m 中 PAM 密度更高，小胶质细胞-斑块界面增强。
对显著变化的蛋白质进行基因本体论 (GO) 富集分析揭示了与炎症反应、脂质代谢缺陷、补体依赖性细胞毒性增加和细胞氧化应激有关的途径发生了改变。第二次比较是在 CD33m 与 5XFAD 对照上进行的，其中 40 种蛋白质在 CD33m 中显著增加，而 235 种蛋白质与 5XFAD 对照相比有所减少。在蛋白质候选物的显著 GO 条目中，吞噬作用/吞噬作用增加、神经元健康和神经支配增强以及脂质合成和储存改善是发生改变的主要生物过程。最后，对于第三次比较，CD33M 与 CD33m，17 种增加的蛋白质和 122 种减少的蛋白质显示出显著的变化。在改变的生物过程中，吞噬作用或吞噬作用的降低，以及细胞粘附、神经形态发生和神经元重塑的紊乱，都是一致确定的。接下来， 进行了更深入的研究，根据细胞类型对已识别蛋白质列表进行聚类，并探索蛋白质组中细胞特异性的变化。
稳态（例如 P2Ry12 和 Tmem119）和活化（例如 CD9 和 Lgals3）小胶质细胞标记物的比较分析表明，与对照 5XFAD 和 CD33M+ 细胞相比，CD33m+ 小胶质细胞的活化作用增加。在小胶质细胞簇中，CD33m+ 小胶质细胞中还发现了一些其他值得注意的蛋白，它们丰度更高，包括与小胶质细胞代谢重编程相关的 Mtk1（金属硫蛋白 1）和参与神经免疫串扰的神经保护性生长因子 Mdk（中期因子）。此外，CD33m+ 小胶质细胞的蛋白质水平降低，例如 Bin2（桥接整合子 2），这种蛋白质在 AD 大脑中含量丰富，与淀粉样蛋白驱动的神经炎症有关，以及 Rac2（Rac 家族小 GTPase-2），这种蛋白质与小胶质细胞炎症反应的有害影响（如细胞凋亡）有关。值得注意的是， 重点研究了其他细胞类型，发现 CD33M+ 小鼠星形胶质细胞中 Fgfr3（成纤维细胞生长因子受体 3）的蛋白质水平较高，这与有害影响有关。还观察到 CD33M+ 小鼠中两种神经元蛋白的水平增加，Arc（活性调节细胞骨架相关蛋白）已被证明在 AD 大脑中含量丰富，而 Chrm2（胆碱能毒蕈碱受体 2）则突出了胆碱能神经元的过度激活和损伤。
图4. 定量蛋白质组学揭示表达 hCD33 亚型的 5XFAD 小鼠大脑中蛋白质丰度的变化
结果5：小胶质细胞的转录分析支持 hCD33 亚型的不同效应
为了进一步探索导致 hCD33 亚型在调节小胶质细胞反应方面存在差异的原理， 对8个月龄时从所有三种基因型的 5XFAD 小鼠（每种基因型汇集 2 只雄性小鼠）的全脑中提取的小胶质细胞以及年龄匹配的非 5XFAD 对照进行了单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 分析。在实施质量控制措施后，将四个数据集合并并使用 Seurat V5 进行聚类，并应用单细胞聚类评估框架 (SCCAF) 根据 Hexb、Fcrls、Sall1、Tmem119 和 P2ry12 的经典小胶质细胞基因表达重新聚类细胞。总体而言， 获得了 21,714 个细胞，经过质量控制后减少到 15,200 个。将聚集的细胞投影到均匀流形近似和投影 (UMAP) 上，以识别十四个簇，分为六大类：边界相关巨噬细胞 (BAM)、稳态小胶质细胞 (HM)、过渡小胶质细胞 (TM)、RNA 结合蛋白小胶质细胞、髓鞘转录本富集的小胶质细胞 (MTEM) 和疾病相关小胶质细胞 (DAM)（图 5a）。应用三种不同的积分方法以消除任何潜在的批次效应，保留了几乎所有的主要识别簇。此外，对所有 5XFAD 队列中 hCD33 转录本水平的评估证实，在转录本水平上，CD33M+ 5XFAD 和 CD33m+ 5XFAD 中的 hCD33 转基因均未相对于 mCd33 过度表达，这与之前在稳态条件下报告的值一致。
四组小鼠（图 5b-e）在每个亚群中细胞分布不同（图 5f、g）。增殖性小胶质细胞表达经典增殖基因，如 Mki67 和 Top2a（图 5h）。BAM 存在于脑膜和血管周围间隙中，表达 Mrc1 和 Ms4a7 等标记物。鉴定出三个高度相关的 HM 簇，富含 5XFAD CD33M。在 HM 附近，发现了两个小胶质细胞簇，将其称为 TM，因为它们表达的 Trem2 水平高于 HM 小胶质细胞。MTEM 表达非小胶质细胞、少突胶质细胞谱系细胞转录本 Mbp 和 Plp1。尽管进行了质量控制以去除双联体，但这些细胞仍然存在，其他人已使用 5XFAD 模型对其进行了鉴定。发现 CD33M 小胶质细胞在 MTEM 簇中不太常见。
根据 Iftm3 和 Irf7 的表达， 确定了一种干扰素反应性小胶质细胞 (IRM) 状态。研究表明，IRM 围绕斑块并有助于补体介导的突触消除。在这里， 发现 CD33m 和 5XFAD 对照是 IRM 的主要来源，这表明 IRM 可能支持 CD33m 促进的吞噬活动。根据经典 DAM 标记 Clec7a 和 Axl 的表达确定了三种不同的 DAM 亚群，这些亚群在非 5XFAD 组中不存在（图 5f、g）。除了这些经典的 DAM 标记之外， 还确定了一个专门富含趋化因子 Ccl3 和 Ccl4 的 DAM 簇。最近有报道称这些因子由小胶质细胞释放，并作用于神经元 Ccr5 以破坏自噬。CD33m 小胶质细胞在 Ccl3 DAM 中富集，并且 DAM 群体富含这些基因，但也表达了高水平的 Trem2（称为 Trem2 DAM）。HM 簇中 CD33M+ 小胶质细胞的富集和 DAM 簇中 CD33M 小胶质细胞的减少让人联想到缺乏 TREM2 的小鼠。鉴于 DAM 表达与吞噬作用相关的基因，例如 Cd86、ApoE、Lpl 和 Cst7，这些数据与 CD33m+ 小胶质细胞中增强的吞噬作用一致。为了跟进这些发现， 对基因型进行了伪批量比较，并始终观察到 CD33m+ 小胶质细胞中的 DAM 水平高于 CD33M。为了解释每种基因型的详细整体变化， 对顶级 DEG 进行了 GO 富集。这些分析表明，CD33m+ 小胶质细胞的代谢适应性、吞噬作用和细胞迁移能力增强。CD33M+小胶质细胞表现出神经免疫反应、细胞移动和迁移以及细胞活化方面的缺陷。还检查了几种基因的特定表达水平，包括 Apoe、Clec7a、Tmeme119、Rac2 和 Mki67。编码巢蛋白 (Nes) 的基因表达是 DAM 特有的（图 5i），并且与蛋白质组学数据一致，其转录水平在 CD33m+ 小胶质细胞中统计上更高（图 5j）。据报道，激活的 Nestin+ 小胶质细胞具有高水平的其他中间纤维成分，如波形蛋白 (Vim) 以及 NG2 (Cspg4)， 在数据集中检查了这些基因的表达水平，并观察到 CD33m+ 中表达水平最高。
接下来，我对一些 scRNAseq 进行了正交验证，并通过 PAM 的 IF 染色特别观察了 Clec7a 蛋白（一种 DAM 标记）。发现了类似的变化，并且与其他组相比，CD33m+ 小鼠的 Clec7a 水平明显更高。研究还发现了两簇富含 RNA 结合蛋白的小胶质细胞（称为 RBM1 和 RBM2），例如 Fus 和 Son。RBM1 和 RBM2 表达的 DAM 标记物水平较低，表明它们与 DAM 类似，而 RBM2 表达的 Apoe 水平较高，表明这是一个反应性更强的小胶质细胞群。发现 RBM 中的 CD33M 和 CD33m 之间没有明显差异。还观察到 5XFAD-CD33m 小胶质细胞中 Jun 和 Fos 等直接早期基因 (IEG) 上调 (图 5k、l)。Fos 被募集到小胶质细胞中清除和病原体识别受体的增强子中，这与 Fos 上调代表更警觉的状态相一致。
图5. 单细胞 RNA 测序显示 Ccl3 和 Trem2 DAM 在 CD33m 基因型中富集结果6：hCD33 亚型对神经元健康和行为有显著影响
hCD33 亚型对总 Aβ 水平以及斑块组成的显著影响促使进一步探索它们对小鼠神经元健康和神经行为的影响。与 5XFAD 对照组相比，GO 富集分析提示 CD33m 小鼠的神经元健康状况有所增强。此外， 通过染色 LAMP1（肿胀神经斑块中溶酶体囊泡的标志物）分析了营养不良神经突 (DN)。对下托内和下托附近额叶皮质部分 DN 的量化进一步支持了 CD33M 和 CD33m 分别具有有害和保护作用。CD33M 小鼠的营养不良性神经突水平明显高于 5XFAD 对照组，而 CD33m 小鼠的营养不良性神经突水平低于 5XFAD 对照组（图 6a、b）。单个 DN 的量化显示，与其他两组相比，CD33M 小鼠的平均 DN 较大（图 6c、d）。此外，与 5XFAD 对照组和 CD33M 组相比，CD33m 中较小的神经斑块具有更多 PAM 数量（补充图 18a、b）。对神经斑块中弥漫性沉积物与致密性沉积物的量化显示，在所有基因型中，不到 40% 的 DN 构成弥漫性斑块（补充图 18c），在这方面各组之间没有显着差异。对 DN (LAMP1) 和小胶质细胞 (Iba1) 面积的相关性分析表明，5XFAD 对照小鼠中存在显著相关性，而 CD33M 或 CD33m 组中没有特定的相关性（补充图 18d-f）。最后，对每个 DN 内 LAMP1+ 面积与 Aβ 面积的相关性分析表明，在所有单独评估的基因型和组合中均存在显著的正相关性。
该研究还对一小群 5XFAD 雌性小鼠（5XFAD 对照、CD33M 和 CD33m）进行了试验性开放场测试，这些小鼠 1 岁大。该行为测试以前曾用于识别 5XFAD 小鼠与焦虑和探索行为相关的认知表现改变。与其他组相比，CD33m+ 小鼠在中心停留的时间明显更长，而其他参数（例如整个竞技场和中心的总距离和平均速度）没有任何差异（补充图 19a-d），这表明与 CD33M 和 5XFAD 对照组相比，这些动物的焦虑减少，神经行为结果改善。为了更好地将这些结果与 在 8 个月时的其他病理分析进行比较， 对更大的雄性和雌性小鼠群体重复了这些研究，重点关注 5XFAD 对照组和 CD33m 5XFAD 组，以评估 CD33m 的功能获得效应带来的认知结果。在八个月时，两组在开放场测试中没有显著差异。因此， 进行了明暗箱实验作为小鼠焦虑的更可靠测量，并发现 CD33m 的小胶质细胞表达在 5XFAD 背景下降低了焦虑（图 6e）。这种效应仅对雄性有影响，但在两性的混合小鼠中仍然很显著。在同一时间点使用自发 Y 型迷宫试验测试了这些小鼠的空间工作记忆，发现与 5XFAD 对照组相比，CD33m+ 小鼠的交替指数有所增加（图 6f）。这种影响只限于雄性，但在两性的混合小鼠中仍然很显著。各组之间的总交替次数没有显著差异（图 6g），这表明 CD33m 组观察到的交替指数显著增加不是由于运动活动的变化。
图6. hCD33亚型影响神经元健康和动物行为
小结
揭示AD易感因素的功能方面可以确定可能用于开发新型、有前途的治疗方法的途径。次要 CD33 SNP 的 AD 保护作用促使 创建一个平台并独立研究与 AD 风险相关的两种 CD33 蛋白亚型的功能丧失和功能获得作用。总体而言， 的结果表明，由 CD33 基因座介导的 AD 易感性是一种复杂的表型，源于 hCD33 亚型对调节小胶质细胞对 Aβ 沉积的反应的独立和相反的影响。hCD33 亚型在小胶质细胞中的不同作用会影响总 Aβ 水平和斑块组成，随后对动物的神经元健康和认知功能产生下游影响。
