Cell：大脑研究的“利器”——清华戴琼海/郭增才/吴嘉敏团队合作研发介观尺度三维显微成像技术_

深入了解生物活体内各个细胞间的相互作用一直是生命科学领域的一项重要课题。一台介观尺度的显微镜可以帮助我们同时观测到整个活体器官中单个细胞的动态变化，可以让我们站在更高的层次上理解生命体的工作机制。然而，想在这样大的视场里做到单细胞分辨率也并不是一件容易的事情，首先，系统的光学像差会随着视场的变化而有巨大的改变，这会影响对整个视场的观测。再者活体样本也会带来极其复杂的像差以及组织的散射荧光背景，严重干扰成像的质量。除此之外，传统三维成像技术需要轴向扫描会带来很大的光毒性，导致成像的速度和时长受到限制。这些因素都限制了介观尺度显微成像技术的发展，也制约了脑科学，免疫学，病理学等进步。

针对这些问题，2024年9月13日，清华-IDG/麦戈文脑科学研究院三个团队，分别来自清华大学自动化系戴琼海、清华大学基础医学院郭增才、清华大学自动化系吴嘉敏，作为共同通讯在Cell上发表题为：Long-term mesoscale imaging of 3D intercellular dynamics across a mammalian organ的研究论文，研制了一台大视场高分辨率的三维介观尺度荧光显微镜（RUSH3D），视场达到8 mm×6 mm，系统分辨率高达3 μm×3 μm×6 μm，并且具备低光毒性的优点，可以以20Hz体成像的速率连续拍摄数小时。

系统借鉴了戴琼海2021年发表在Cell上提出的亚像素扫描和数字自适应光学架构，并引入波动光学理论进一步优化了该框架，可以做到更大视场内多区域像差的快速精准矫正，实现超高空间分辨率并在全视场内保持一致。交叉研究团队利用RUSH3D在活体小鼠的大脑皮层以及腹股沟附近处淋巴结等组织发现了一系列现象。包括小鼠运动过程中，大脑皮层神经元发放的规律，以及多感官刺激下皮层各脑区的响应模式；免疫反应过程淋巴结内生发中心的形成过程，以及T淋巴细胞在生发中心之间的迁移；急性脑损伤后中性粒细胞的迁移与回流，为脑科学，免疫学，病理学的研究提供了新路径。

图1. RUSH3D成像效果

由于数据通量以及光学像差的限制，传统显微镜很难兼顾大视场以及高分辨两个特性，为了克服这个难题，戴琼海课题组曾在2019年研制了世界首台高分辨介观尺度成像显微镜—RUSH，RUSH采用相机阵列实现高通量数据采集，并采用专门设计的大物镜消除像差。然而活体三维成像中样本带来的复杂像差以及三维成像的速率及光毒性仍然是个难题。RUSH3D系统采用了亚像素扫描和基于波动光学理论的数字自适应光学框架，仅用一个成本较低的单透镜和单个相机，就实现了超高空间分辨率并在全视场内保持分辨率一致，同时克服了系统像差和样本像差的难题。除此之外，RUSH3D无需轴向扫描，单次拍摄即可重建得到轴向范围400 μm 的三维成像结果，具有高速体成像和低光毒性的优势。RUSH3D具有目前世界最大的数据通量，相比原来的RUSH系统，提升10倍以上。

光学像差会严重影响系统成像的分辨率，同时会随着视场扩大而剧烈变化，同时样本的复杂像差会进一步损害成像质量。目前诸多硬件自适应光学技术存在如下问题：成本高，视场有限等，为了更好解决复杂像差问题，RUSH3D通过获得全视场超精细的四维空间角度光场数据，基于波动光学，使用数字自适应光学架构（DAO），无需在光学系统中增加额外的波前传感器或者空间调制器，在后端完成大视场多区域自适应光学，从而提升大视场复杂环境三维成像的空间分辨率。

除此之外，活体荧光成像中背景荧光严重影响了成像的信背比。为了改善这一问题，RUSH3D采用低分辨率快速重建实现背景信号和在焦信号的分离，从而减少了离焦信号的影响，即多尺度去背景算法（MBR）。MBR相当于一个高通滤波器，精准的滤除散焦背景，从而提升成像信背比，恢复淹没在荧光背景中的荧光信号。

研究人员利用RUSH3D这台三维介观成像系统的独特优势进行了一系列的活体成像实验，并发现了一些有趣的现象。

大脑皮层是神经系统的高级中枢，而神经元是神经系统的基本单元。大脑皮层的神经元网络被认为是高等动物神经系统中十分重要而又复杂的信息处理中心，是产生生物智能乃至意识的关键神经网络区域。以往研究发现，皮层功能分化形成了调控各种信息的皮层区域，大脑各皮层区域间神经元的功能性活动和信息交流是皮层发挥功能的重要方式。然而，由于技术限制，目前大部分研究只能同时记录实验动物中一个或几个皮层区域的神经元活动，难以进一步研究皮层神经元网络的联合动态变化。在此研究中，研究人员利用RUSH3D大视场三维高分辨率、高帧率的成像优势，优化神经元信号提取算法，联合小鼠皮层二三层神经元稀疏标记技术，开创性地实现了对头固定下清醒小鼠背侧皮层17个脑区中20000个左右神经元的长时间记录，并且能够对同一群神经元进行跨天的多试次记录。运用此记录手段，研究人员证实了响应感觉刺激、调控运动的神经元并非只存在于单一的感觉皮层、运动皮层，而是广泛存在于皮层各个区域，但各个区域神经元对感觉信息编码、整合、区分的能力存在差异。研究人员进一步记录、分析了小鼠自主运动行为时的皮层神经元网络活动。首先，他们发现在运动时，大多数皮层神经元对视觉和触觉刺激的响应会下降，但视觉皮层神经元在运动时对视觉刺激的响应却更多为上升。通过对自主运动发起时皮层活动的进一步分析，研究人员发现自主运动行为发起时，小鼠皮层神经元网络由尾侧向鼻侧传导的发放模式。这一结果提示视觉、触觉等感觉皮层神经元的的信息整合和全皮层范围的信号扩散可能是引起自主运动的关键因素。

图2. 全脑皮层神经成像

生发中心（Germinal center, GC）是被抗原激活后的B细胞在趋化作用引导下聚集形成的结构。由于受到视场和拍摄时长的限制，免疫细胞如何参与多个GC生成以及如何在多个GC间进行迁移的过程从来没有被连续记录过。RUSH3D拍摄了小鼠腹股沟附近淋巴结在免疫反应85个小时左右，B细胞参与多个GC生成的过程。除此之外，还记录了在免疫反应145个小时GC已经完全形成之后，一些T细胞在GC之间完整迁移的过程。预示了T细胞可能参与了GC之间的信息交流和传递。

图3. T淋巴细胞在多个生发中心之间迁移的完整过程

除此之外，研究人员还观测了急性脑损伤后，大脑皮层里中性粒细胞的迁移活动。这得益于RUSH3D可以克服巨大的样本像差，透过透明颅骨进行清晰的成像观测。当小鼠的脑部受到撞击以后，大量的中心粒细胞从血管中流出进入脑实质，也有极罕见的细胞从脑实质回流到血管里，这意味着有些细胞可能在完成免疫反应后，会流回血管中将信息传递到生物体的其他地方。以上这些新发现都意味着RUSH3D可以在将来为生命科学提供新视角，助力生命科学重大问题的突破创新。

图4. 脑急性损伤后中心粒细胞的迁移过程

清华大学自动化系博士后张元龙，深圳国际研究生院博士生王鸣瑞和基础医学院博士生朱齐禹是本文的共同一作，清华大学自动化系戴琼海院士、清华大学基础医学院郭增才副教授、清华大学自动化系吴嘉敏副教授为本文的共同通讯作者，郭钰铎，刘波，李嘉敏，姚啸，孔垂，张亿，黄予超，祁海参与并作出重要贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、国家科技部重点研发计划、以及清华-IDG/麦戈文脑科学研究院Brain+X项目的大力支持。