滩羊是宁夏、甘肃、陕西等西北地区的优势畜种，宁夏盐池县更是被誉为“滩羊之乡”。宰后肌肉成熟期间，肌肉pH值、糖酵解、肌肉中基因的变化等均会显著影响肉品质，这些因素共同调节肌肉中相关基因的变化改变肌肉代谢，从而决定肌肉的品质，因此，动物宰后导致肌肉品质改变的重要原因是基因的变化。近年来，运用转录组学解析肉品品质变化已经成为了热点。
宁夏大学食品与葡萄酒学院的陈雪妍、杨波、罗瑞明*等人采用转录组学技术研究不同成熟时间冷却滩羊肉中的基因表达情况，筛选并分析DEGs，鉴定出糖酵解途径上影响滩羊肉品质的核心基因，为完善滩羊肉质量控制技术提供一定的理论指导。
1转录组测序和de novo组装数据分析
对来自样品的9 个cDNA文库进行测序，共获得57.02 Gb的序列，394、491、196 个原始序列和380、156、994 个过滤序列，其中96、525、684 个过滤序列来自样品。样品的碱基测序错误率为0.02%。如表2所示，9 个文库过滤序列的从头组装产生了77709 个单基因，总长度为59960697 BP，其中N50为672 bp。从头组装详细信息如表3所示。
2 DEGs筛选
以FC＞1.8或＜1/1.8且P＜0.05筛选DEGs，结果表明，4 d vs 0 d组一共鉴定出1059 个显著DEGs，326 个显著上调表达，733 个显著下调表达（图1A）；8 d vs 4 d组一共鉴定出289 个显著DEGs，133 个显著上调表达，156 个显著下调表达（图1B）。
3 DEGs生物学分析
GO功能注释富集分析
采用GO注释对筛选出的DEGs做生物信息分析。生物过程、细胞组分和分子功能的结果表明，4 d vs 0 d组富集到1653 个生物过程、193 个细胞组分和326 个分子功能；8 d vs 4 d组富集到1035 个生物过程、114 个细胞组分和155 个分子功能。
由图2A可知，宰后成熟0～4 d，DEGs涉及的生物过程主要包括翻译、肽代谢过程、酰胺生物合成和有机氮化合物代谢等；分子功能主要包括核糖体、核糖体蛋白质复合体和细胞内核糖蛋白复合体等；细胞组分主要包括核糖体结构成分、结构分子活性、肽酶调节活性等；以上结果表明，宰后初期核糖体、收缩纤维、肌原纤维等构成滩羊肌肉结构和影响滩羊能量代谢的基因发生变化，可能引起了骨骼肌收缩和结构分子活性降低，这些基因位于细胞质中，主要负责离子转运、细胞骨架蛋白结合和肌动蛋白结合等功能。
由图2B可知，宰后成熟4～8 d，DEGs涉及的生物过程主要包括细胞酰胺代谢过程、ATP代谢过程、骨骼肌收缩和多细胞生物运动等；细胞组分主要包括细胞骨架部分、核糖体和大核糖体亚基等；分子功能主要包括核苷三磷酸酶活性、水解酶活性和核糖体结构等。以上结果表明，成熟4 d后的滩羊肉，DEGs变化除了引起肌肉收缩、细胞酰胺代谢，还涉及了ATP等代谢过程和酶活性的变化。
KEGG 通路分析
采用KEGG通路对筛选出的DEGs进行通路注释分析。4 d vs 0 d组富集到5 个通路，8 d vs 4 d组显著富集到6 个通路。由图3A可知，DEGs在宰后成熟0～4 d参与的通路主要有核糖体、糖酵解、心肌收缩、p53信号通路、胆汁酸生物合成；由图3B可知，DEGs在宰后成熟4～8 d参与的通路主要有核糖体，糖酵解，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，趋化因子信号通路等。这些代谢过程可能通过影响相关基因参与的生物学过程间接影响肌肉的品质。
4 核心网络构建
采用Venn筛选不同成熟期共有的DEGs，发现0～4 d与4～8 d两个成熟期共有的DEGs为50 个（图4）。通过String对共有的DEGs进行蛋白质互作（PPI）网络分析，结果表明该网络中PPI富集的P值为2.16×10-9，聚类系数为0.334，发现了47 个节点数，33 条边位于该互作网络中（图5），该结果表明，24 个DEGs之间具有明显的互作关系。将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1进行核心互作网络筛选，5 个糖酵解相关基因处于该核心网络中（图6）。
PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH基因均为滩羊后腿肉糖酵解相关基因。由表4可知，PFKM、PKM、PGAM2和ENO3在0～4 d内上调表达可能是由于肉屠宰后糖酵解被迅速开启，维持肌细胞无氧代谢。4～8 d内约半数基因发生下调，表明成熟后期多数糖酵解相关基因可能由于滩羊肉中的环境和微生物等的相互作用被降解。
5 个DEGs位于细胞器上，与离子或细胞骨架蛋白结合，参与ATP代谢以及骨骼肌收缩，富集于糖酵解代谢通路，表明这些DEGs通过改变肌肉结构分子活性和水解酶活性，从而影响滩羊肉的品质。
5 real-time PCR验证
为验证RNA-Seq结果，选择核心网络中5 个糖酵解途径上的DEGs，并应用real-time PCR测定基因相对表达水平（图7）。表5显示，基因表达与来自RNA-Seq结果的FPKM值一致，表明转录组测序数据可靠。
讨 论
通过转录组分析，总共组装了77709 个单基因，N50为672 bp，其中64.46%可以被注释。采用GO和KEGG富集分析对1348 个DEGs进行了分类。4 d vs 0 d组GO富集的3 个功能类别中最主要的分别是有机氮化合物代谢、核糖体蛋白质复合体和结构分子活性（图2A），8 d vs 4 d组这3 个功能类别中最主要的分别是细胞酰胺代谢过程、细胞骨架成分、核苷三磷酸酶和水解酶活性（图2B）。表明0～4 d期间，位于核糖体的基因参与有机氮化合物代谢过程等，这些基因编码的蛋白质具备结构分子活性等功能。4～8 d期间，位于细胞骨架的基因参与调控细胞酰胺代谢等过程，这些基因编码的蛋白质具备ATP酶和水解酶等功能。这些变化的基因引起线粒体ATP合成耦合质子转运、氢离子跨膜转运，导致滩羊肉肌纤维结构变化，从而引起肉能量水平及品质的改变。此外，KEGG富集分析表明，4 d vs 0 d组富集DEGs较多的是核糖体、糖酵解、心肌收缩、p53信号通路、胆汁酸生物合成（图3A），8 d vs 4 d组富集DEGs较多的是核糖体、糖酵解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、趋化因子信号通路等（图3B）。其中糖酵解、核糖体和p53信号通路为不同贮藏期间DEGs共同注释到的代谢通路，这些途径是肌肉细胞功能的关键部分。核糖体是mRNA进行翻译的主要场所，主要由核糖体RNA和多种核糖体蛋白构成，是一类高度复杂的细胞器。为了增殖，活细胞在细胞周期中生长和分裂，细胞周期受到各种检查点的严格控制，p53信号通路就是公认的对细胞凋亡至关重要的通路，p53基因能够抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）途径发出生长因子可用性的信号，并刺激营养摄取以支持mTOR依赖性细胞的生长和增殖，而AMP活化蛋白激酶（AMPK）途径则发出能量不足的信号并触发p53依赖性应激反应。Chen Li等研究发现宰后早期的蛋白质磷酸化可能通过调节参与糖酵解和肌肉收缩的蛋白质间接影响糖酵解途径，其中PFKM为磷酸蛋白，PFKM在被AMPK磷酸化后被激活，以上调糖酵解并维持细胞内ATP稳态。糖酵解是宰后肌肉产生能量的主要途径，Jiang Shengwang等研究表明，糖酵解和肌肉pH值、细胞应激反应和细胞凋亡、肌肉收缩和僵硬、钙信号传导和蛋白水解、次黄嘌呤核苷酸合成和肉味发育，甚至调节色素蛋白和肉色的稳定性都能影响肉质变化。因此，宰后肌肉代谢的转换和肉品质变化均与贮藏期间肌肉转录水平的变化密切相关。
对筛选到不同成熟期共有的50 个DEGs进行核心互作网络筛选，结果表明，PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH处于该核心网络中，且全部为滩羊肉糖酵解途径上调控肉质的相关基因，几个基因之间具有密切的调控关系，某一基因表达水平改变就会影响其他几个糖酵解基因表达水平的变化。核心基因对糖酵解途径的调控如图8所示，PFKM是催化6-磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖这一不可逆反应的关键调节酶，是PFK的一个亚型。6-磷酸果糖激酶主要通过PFKM基因影响糖酵解的速率，并且PFKM基因的相对表达量直接影响糖酵解的反应速率。许金蔓研究发现PFKM表达改变也可以导致线粒体功能的改变，导致肌肉变质。PKM是糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的最后一个关键酶，PKM在糖酵解骨骼肌的长胸肌中显著表达，其丰度与肉品质的pH值和滴失有关。此外，GAPDH还通过降低屠宰后肌肉的pH值影响肉质。研究表明，PFKM、PKM、GAPDH是糖酵解过程中的关键酶，影响糖酵解肌肉表型。PGAM是糖酵解中的关键酶，可将3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸，在哺乳动物细胞中以两种亚型表达：脑（PGAM1）和肌肉（PGAM2）。PGAM2基因编码一种肌肉酶亚型，该亚型参与丙酮酸厌氧转化为乳酸之前糖酵解途径的最后步骤之一。PGAM2的过表达增加了3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸水平。Okuda等研究发现PGAM2与死后乳酸水平密切相关，Yang Haoxin等研究表明PGAM2表达水平与持水能力呈负相关，这种基因在协调能量产生与还原力的产生以及核苷酸前体和氨基酸的生物合成方面起着重要作用。ENO3也是一种糖酵解酶，主要存在于肌肉组织中，具有强大的能量代谢功能。Wu Jian等等分离出猪ENO3基因的全长cDNA，发现ENO3转录本1在肝脏和肺中高表达，转录本2在骨骼肌和心脏中高表达，表明烯醇化酶可能在骨骼肌发育和肌肉分化过程中起重要作用，且ENO3基因可能是动物育种中肉质和胴体性状的重要候选基因，并可能参与肌肉发育机制。综上所述，滩羊宰后通过影响糖酵解核心基因对酶和复合物活性、结构蛋白的降解程度、ATP的产生及肌纤维结构的改变影响品质。
结 论
利用RNA-Seq筛选出的DEGs位于细胞器、细胞外区和核糖体，与离子或细胞骨架蛋白结合，参与ATP酶活性的调节以及肌肉收缩，引起线粒体ATP合成耦合质子转运、氢离子跨膜转运，导致滩羊肉肌纤维结构变化，从而引起肉能量水平及品质的改变。分析鉴定出PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH为影响滩羊肉品质的核心基因，且全部为糖酵解途径相关基因，通过影响肌纤维结构、结构蛋白的降解程度、糖酵解酶活性、ATP的产生和复合物活性等进一步影响肉品质。
本文《冷却滩羊肉的转录组学分析》来源于《食品科学》2023年45卷第1期50-57页，作者：陈雪妍，杨波，罗瑞明*，张倩，王金霞，李荣，胡丽筠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230404-037。
