乳清分离蛋白（WPI）是在乳清蛋白的基础上加工得到的高纯度蛋白质，可作为食品的功能性成分，如乳化剂、发泡剂、增稠剂、凝胶剂等。但WPI对温度、离子浓度、酸碱性等环境条件敏感，易造成WPI溶解度和乳化稳定性降低以及出现胶凝和聚集现象。自由基接枝共价修饰是一种有效修饰WPI的方法，可以提供理想的物理化学性质和功能。前期实验通过自由基接枝制备WPI-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）接枝物，发现其抗氧化性和乳化性得到明显改善。
姜黄素因具有抗氧化、抗炎、降血脂等多种生理功效而在食品和医药领域得到广泛关注和应用。但姜黄素水溶性较差，人体难以通过口服的方式吸收，从而造成其较低的生物利用度。
华南农业大学食品学院的李艳新、陈立莹、李璐*等以姜黄素作为模型营养物，以WPI和不同接枝率的WPI-EGCG为乳化剂构建姜黄素纳米乳液，并对其体外消化性能进行研究，为姜黄素在食品领域的功能化应用提供思路和数据基础。本实验旨在探讨WPI和不同接枝度的WPI-EGCG接枝物之间的消化差异。首先，对接枝前后WPI的结构和界面变化进行表征。然后，使用不同接枝率（3%和4%）的WPI-EGCG接枝物和未改性的WPI作为乳化剂制备负载姜黄素的纳米乳液。最后，构建三阶段体外消化模型，研究不同姜黄素纳米乳液体系在各阶段的消化行为，分析WPI-EGCG接枝和接枝度差异对所构建纳米乳液体系体外消化的影响及规律。
1 WPI接枝前后的结构变化
1.1 二级结构和酪氨酸含量的变化
用圆二光谱仪和紫外分光光度计分别研究接枝前后WPI的二级结构和酪氨酸含量的变化，结果见表1。与未修饰的WPI相比，接枝后WPI-EGCG的α-螺旋相对含量下降到19.9%，β-片状相对含量上升到42.6%，说明与EGCG的结合可能导致WPI分子结构的部分扩展。酪氨酸含量的减少是由于多酚与蛋白质中的酪氨酸有更强的相互作用，与更多的疏水氨基酸结合，表明更多的疏水残基暴露在外界环境中或在EGCG的作用下转移到亲水环境。
1.2界面蛋白吸附量的变化
蛋白质具有两亲性，当蛋白质吸附在油滴表面时，可以降低界面张力，形成高强度具有黏弹性的膜，从而防止油滴结块或絮凝。蛋白质的界面吸附量越高，界面膜越厚，说明蛋白质对油水界面的吸附能力越强，作为乳化剂构建乳液体系时可以形成更稳定的界面结构。如图1A所示，WPI-EGCG的界面吸附膜厚度为127.6 nm，明显大于WPI的界面吸附膜厚度（96.0 nm），增加了31.6 nm。这可能是由于EGCG改变了蛋白质的二级结构，使其向无序方向展开，从而使分子在油水界面迅速吸附，并紧密地相互作用，形成较厚的乳化层。图1B是WPI和WPI-EGCG乳化剂吸附在油水界面上形成的界面层的示意图。
2 体外消化实验结果
上述结果表明，WPI接枝EGCG后的分子结构和界面性质发生了变化，这可能会影响以WPI-EGCG为乳化剂的纳米乳液的消化率。因此通过构建体外模拟消化模型，探讨乳剂在不同消化阶段的粒径、势能、微观结构和脂肪酸释放情况。
2.1 消化阶段纳米乳液粒径变化
从图2A～C可以看出，在初始阶段，3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG乳液的粒径呈单峰分布（多分散指数分别为0.034和0.040），而WPI乳液在5000 nm处还有1 个小峰（多分散指数为0.23），说明WPI稳定乳液的粒径分散较大。表明自由基接枝物能发挥较好的乳化活性，能够快速吸附至油水界面并形成稳定的乳液。
图2D显示，在不同的消化阶段，WPI-EGCG稳定的纳米乳液液滴尺寸更小，可能原因是EGCG与WPI的共价结合破坏蛋白质二级结构，导致WPI去折叠和内部疏水氨基酸的暴露，提高了表面活性，从而有利于WPI快速吸附至油水界面。
2.2消化阶段纳米乳液Zeta电位变化
图3显示，WPI以及WPI-EGCG纳米乳液在消化前的Zeta电位绝对值均大于30 mV，因此这3 种纳米乳剂都具有抗絮凝能力。由于WPI或WPI-EGCG接枝物在油水界面的吸附，乳化液滴之间发生了强烈的静电排斥现象，从而使纳米乳剂具有良好的物理稳定性。然而，由两种接枝物稳定的纳米乳液比单独由WPI稳定的纳米乳液具有更高的负电位（P＜0.05），原因可能是接枝物在液滴表面形成更厚的蛋白吸附层，进一步增加了乳液液滴之间的静电排斥，从而抑制液滴之间的聚集，提高乳液的物理稳定性。此外，Zeta电位随着WPI-EGCG接枝率的增加而降低，这是因为具有较大接枝率的WPI能够形成更加坚硬和致密的表面结构，减缓胃蛋白酶对乳化剂的消化。
2.3消化过程中纳米乳液微观结构分析
如图4所示，在消化前不同纳米乳液样品的液滴呈现均匀分布，未观察到乳液聚集现象，说明姜黄素可以有效地包裹在3 种纳米乳液中。进入口腔消化后，大多数油滴在口腔条件下仍然保持稳定。经过胃液消化后，所有样品的微观结构都有明显的变化，3 种纳米乳液中小油滴消失，出现许多由大油滴形成的絮状物。此外，3%、4% WPI-EGCG接枝物稳定纳米乳液中的絮凝相对小于WPI稳定纳米乳液，且分布较均匀，证实了粒径分布结果，表明接枝物制备的纳米乳液更加稳定。图4显示，大部分乳滴在小肠阶段已被消化，还有一些个别粒径较大的乳滴，这可能是由于脂肪酶消化油相，并将脂质消化产物并入混合胶束和囊泡中，从而产生较大的油滴。
2.4纳米乳液中脂肪释放分析
如图5所示，WPI、3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG制备的纳米乳液体系遵循相似的脂肪消化规律，在前20 min FFA的释放率快速增加，20 min后，释放趋于平缓直到达到相对恒定的最终值。出现这一种情况主要是因为，脂肪酶在消化的前20 min水解三酰基甘油，三酰基甘油几乎被水解后，FFA释放变得缓慢。比较3 种乳化剂制备的姜黄素纳米乳液的FFA释放量，WPI-EGCG接枝物稳定的纳米乳液中脂肪消化速率稍快一些，这是因为脂肪消化速率与乳液的粒径大小密切相关。经WPIEGCG接枝物稳定的纳米乳液，由于平均粒径较小，在胃液中油滴簇也较小，油滴的比表面积较大，更有利于脂肪酶的分解。此外，3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG制备的纳米乳液在消化120 min后，最终的FFA释放率分别为80.68%和85.13%，表明自由基接枝的程度越高，越能更好地促进脂质消化。
2.5姜黄素的生物可及性
通过测量消化结束产生的胶束相中姜黄素含量，可得到姜黄素的生物可及性。由图6可知，WPI、3% WPIEGCG和4% WPI-EGCG制备的姜黄素纳米乳液的生物可及性分别为19.18%、20.04%和21.53%，该结果与乳液在模拟肠消化阶段FFA的最终释放量有相同的趋势。这表明WPI与EGCG共价结合提高姜黄素的生物可及性，且随接枝率的增加而增加。这可能是因为WPI-EGCG作为乳化剂被吸附在油水界面上，形成较厚的界面蛋白膜，有效地保护了姜黄素。FFA释放量越高，姜黄素的生物可及性也越高，是因为随着脂肪酶水解增加，更多脂肪消化产物形成胶束，姜黄素从油滴中释放出来，从而提高了姜黄素在胶束相中的溶解度。之前研究也表明，乳液中营养素的生物可及性与脂肪分解程度呈正相关。
3 结 论
研究发现，乳化剂的结构和类型与消化率有一定的相关性。EGCG的结合展开了WPI的二级结构，增加了所制备乳液的界面膜厚度，导致接枝后的WPI具有较小的液滴尺寸和较高的负电位，从而抑制液滴之间的聚集，提高乳液的物理稳定性。相比WPI制备的纳米乳液，采用自由基接枝物制备的纳米乳液有效改善了油脂的消化，提高了体系所包埋的姜黄素生物可及性，且以接枝率为4%的WPI-EGCG接枝物为乳化剂构建的纳米乳液中，姜黄素营养物的生物可及性高于接枝率为3%的乳液体系。因此，WPI-EGCG可作为乳化剂用于调节脂肪消化和脂肪释放，以及促进姜黄素的稳定性和生物可及性。
本文《WPI和WPI-EGCG构建姜黄素纳米乳液的体外消化差异》来源于《食品科学》2024年45卷1期，作者：李艳新，陈立莹，李雁，解新安，李璐。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230228-256。
