上海市农业科学院杨焱研究员、陈万超助理研究员等：大球盖菇酶解液_

鲜味是继酸、甜、苦、咸之后的第5种基本味道，因其口感丰富和愉悦被认为是一种重要的食品风味。许多物质如氨基酸、核苷酸、有机酸、无机盐、多肽等均具有鲜味。食用菌蛋白含量高、味道鲜美，是制备鲜味肽的理想原料。大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）又名赤松茸，属于伞菌目、球盖菇科、球盖菇属，色泽鲜艳、肉质细嫩，具有“素中之荤”的美誉，且营养丰富，烹饪时有肉香味，富含必需氨基酸、维生素、蛋白质、多糖等营养成分，其子实体干品中粗蛋白质量分数高达30%，是制备鲜味肽的优质原料。

上海市农业科学院食用菌研究所的陈荣荣、李文、杨焱*等人以大球盖菇子实体为原料，利用中性蛋白酶和风味蛋白酶对子实体进行内外切酶分步酶解，采用超滤、凝胶过滤色谱（GFC）和反向高效液相色谱-串联质谱（RP-HPLC-MS/MS）技术结合感官评价和电子舌分析，从大球盖菇酶解液中分离纯化并鉴定出8 条鲜味肽，并对其进行合成及呈味特性分析，同时评价其与MSG的协同增鲜效果，并比较鲜味肽与其组成氨基酸混合物的呈味差异，以期为大球盖菇鲜味肽产品的开发和应用提供理论依据。

1 超滤和凝胶色谱分离纯化鲜味肽组分结果

大球盖菇经分步酶解获得酶解物，其可溶性肽含量达到245.45 mg/g，表现出明显的鲜味和菇味，TD值为32（表1）。对酶解物进行超滤分离得到两个组分，其中U2组分（＜3000 Da）鲜味值较高，TD值为32（表1），电子舌和感官评价结果表现出与酶解物相似的味觉属性（表2和图1），且研究表明鲜味肽的分子质量均小于3000 Da，进一步对U2组分进行GFC分离。其利用分子质量大的样品在色谱柱中保留时间短先被洗脱，分子质量小的样品后被洗脱进而对样品达到分离的效果。经GFC共得到4 个组分（图2），其中F4组分占比少且得率低，选取F1、F2和F3进一步分析。感官评定结果显示，GFC分离的3 个组分均表现出鲜味特征，并伴有轻微涩味和甜味，且F2和F3鲜味明显，TD值达到64（表1）。结合电子舌分析结果可知，F3组分鲜味更突出，鲜味值为20.66±0.13，与F2差异显著（P＜0.05），且F3中的可溶性肽含量达到389.42 mg/g，进一步表明其中的鲜味肽可能发挥了极大的作用。因此，本研究选择F3组分做进一步鲜味肽鉴定。

2 RP-HPLC-MS/MS鉴定大球盖菇鲜味肽结果

利用RP-HPLC-MS/MS对F3组分中鲜味肽进行鉴定，获得8 条多肽（ALC＞95%）（图3和表3），分别为Glu-Leu-Trp-Arg（ELWR）、Arg-Leu-Val-Asp-Arg（RLVDR）、Lys-Pro-Asp-Asn-Arg（KPDNR）、Ala-His-Leu-Arg-Phe（AHLRF）、Leu-Asp-Trp-Asp-Arg（LDWDR）、Leu-Ala-Glu-Trp-Arg（LAEWR）、Asp-Asp-Trp-Trp-Arg（DDWWR）、Glu-Gly-His-Lys-Gly-Trp（EGHKGW），肽链长度4～6，且以五肽为主，分子质量在602.3176～776.3242 Da之间。

3 大球盖菇合成肽的呈味特性分析

3.1合成肽的感官特性、鲜味阈值和增鲜阈值

多肽由于其化学性质和构象的多样性，导致其表现出多种味觉特征。利用固相合成法合成了鉴定得到的8 条多肽，并进行了感官评定和电子舌分析（图4）。感官评定结果显示合成肽表现出的滋味轮廓相似，鲜甜味突出，同时咸味和苦味明显，酸味较弱。其中，酸味的产生可能由于合成过程中的试剂残留，亦或由于肽链中的羧基解离强度强于氨基，表现出酸味。电子舌分析可知ELWR鲜味值最高，达到8.39；RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW 4 条多肽的鲜味值均大于7，且RLVDR、AHLRF和EGHKGW表现出更愉悦的滋味特征，鲜甜味及咸味更突出，酸苦味弱；而LDWDR、LAEWR和DDWWR 3 条多肽与其余5 条多肽滋味特征区别明显，表现出鲜咸味值低、苦味值高的特征。当鲜味肽含有谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺残基，且鲜味氨基酸占比较大时，对于鲜味的贡献更大。而鲜甜味氨基酸位于肽链两端时，更利于与鲜味受体结合，更容易产生鲜味。除AHLRF外，8 条多肽均含有鲜味氨基酸，且除AHLRF和EGHKGW外，C-末端均为精氨酸（碱性氨基酸）。多肽中含有碱性氨基酸且末端含有精氨酸的肽段会呈现苦味，苯丙氨酸作为苦味氨基酸也会增强多肽的苦味特征，这可能是多肽表现出苦味的原因。LDWDR、LAEWR和DDWWR更苦可能是由于苦味氨基酸占比较大（60%），或因疏水性氨基酸暴露导致其产生苦味。

由表4可知，8 条肽段均表现出鲜味特征并对鲜味有提升作用，鲜味阈值在0.30～1.33 mmol/L之间，增鲜阈值在0.53～2.43 mmol/L之间。其中LDWDR、LAEWR和DDWWR有苦涩感但鲜味提升效果明显，增鲜阈值与其余5 条多肽之间差异显著且小于1 mmol/L（P＜0.05）；鲜味阈值分别为1.33、0.56 mmol/L和1.13 mmol/L，LDWDR和DDWWR的鲜味阈值显著高于其他多肽（P＜0.05），鲜味强度弱；其次是ELWR、RLVDR、KPDNR和EGHKGW表现出甜味和咸味的味觉特征，并且有较强的鲜味提升作用，增鲜阈值均大于1 mmol/L，鲜味阈值分别为0.52、0.86、0.30 mmol/L和0.44 mmol/L；而AHLRF并未品尝出甜味，鲜味提升效果较弱，增鲜阈值为2.43 mmol/L，鲜味阈值为0.49 mmol/L，增鲜效果最差。8 条多肽中KPDNR鲜味阈值最低为0.30 mmol/L，但雷达图并未显示出其鲜味最强，可能由于其他味觉属性如甜味的协同作用增强了鲜味值，导致感官的鲜味阈值偏低。增鲜效果最好的多肽是LDWDR，其增鲜阈值为0.53 mmol/L，虽然其鲜味阈值最高，鲜味值低，但是在添加0.5 mg/mL的MSG溶液后，展现出更强的鲜味提升效果，可能是由于MSG与合成肽产生了味觉协同作用，导致合成肽味觉属性变化，致使鲜味增强。

3.2合成肽与MSG的协同增鲜效应分析

为进一步探究多肽的协同增鲜效果，将0.2 mg/mL鲜味合成肽添加到2 mg/mL MSG溶液中进行电子舌测定，与0.5～3.5 mg/mL MSG溶液的鲜味值比较。图5显示，添加合成肽后，除LDWDR外，其余7 条多肽对MSG溶液均有不同程度的鲜味提升效果，相比2 mg/mL MSG溶液的鲜味值分别提升了61.12%、29.25%、26.62%、22.94%、14.54%、0.18%、26.44%，添加ELWR、RLVDR、KPDNR和EGHKGW这4 条多肽溶液的鲜味值甚至超出3.5 mg/mL MSG溶液的鲜味值，分别超出了27.78%、2.50%、0.42%和0.28%，且4 条多肽在较低浓度下就表现出极强的鲜味增强效果。从不同质量浓度MSG溶液的咸味值可以看出，添加0.2 mg/mL合成肽溶液的咸味值相比2 mg/mL MSG溶液提升效果显著（除DDWWR外）（P＜0.05），咸味值分别提升了130.83%、139.56%、132.89%、129.00%、2.55%、8.25%和123.67%，添加ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW后，溶液的咸味值超出了3.5 mg/mL MSG溶液的咸味值。

合成肽与MSG的协同增鲜实验表明，鲜味肽加入后对MSG产生了协同作用，从而增强了MSG溶液的鲜味值和咸味值。本研究中，除LDWDR外，合成肽质量浓度在0.2 mg/mL时均能提升溶液鲜味，ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW在低质量浓度时也表现出对MSG溶液良好的鲜味和咸味提升效果。

3.3合成肽在MSG溶液中的剂量-反应关系

剂量-反应实验可以反映在MSG溶液中，合成肽浓度增加对MSG呈味特性的影响，结果如图6所示，随着合成肽质量浓度的提高，8 条多肽均表现出不同程度的鲜味提升效果，鲜味增强曲线呈现先升高后降低的趋势（除AHLRF外），而AHLRF仅在1 mg/mL时对溶液的鲜味具有增强作用，随着浓度提升，鲜味并未增强。LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW 4 条多肽在1～4 mg/mL范围内，使得MSG溶液的鲜味强度急剧增加，当添加的合成肽质量浓度超过4 mg/mL后，高质量浓度合成肽的酸味和苦涩味掩盖或者抑制了鲜味，导致溶液的鲜味强度降低，可见并非质量浓度越高对MSG溶液的鲜味增强效果越好。ELWR、RLVDR和KPDNR也表现出与LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW相似的增鲜趋势，不同的是，ELWR、RLVDR和KPDNR增鲜强度呈现下降的质量浓度分别为3、5 mg/mL和5 mg/mL。此外，RLVDR和KPDNR在达到最高鲜味强度后，随着质量浓度提高，溶液的鲜味强度骤降；而ELWR、LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW这5 条多肽在达到鲜味峰值后，随着质量浓度提升，溶液的鲜味强度则表现出缓慢下降的趋势。总之，多肽在低质量浓度时可能对MSG溶液不具备鲜味提升作用，且随着质量浓度增加鲜味亦不会提升甚至会下降，可见多肽与MSG溶液协同增鲜，质量浓度至关重要。

3.4合成肽与其组成氨基酸混合物的呈味效应比较

为进一步说明多肽的味觉属性并非相应氨基酸味道的叠加，对组成合成肽的氨基酸混合物在水溶液中的滋味特征进行了感官评价（图7），发现8 条多肽与其等质量配比的氨基酸混合液的呈味差异显著。ELWR和RLVDR的组成氨基酸混合液溶液苦味突出，而多肽溶液以甜鲜味为主，主要是由于苦味氨基酸占比高，分别为75%和80%，而多肽由于氨基酸脱水缩合形成肽键及空间结构，可能改变了其呈味特性，从而产生明显的味觉差异；LDWDR、LAEWR和DDWWR的苦味氨基酸占比60%，鲜甜味氨基酸占比40%，合成肽溶液分别突出在鲜味或鲜咸味，而等质量配比的氨基酸混合液则苦味突出，可见鲜味不仅与氨基酸组成和排列顺序有关，肽链构象也会影响鲜味的呈现。KPDNR和EGHKGW溶液鲜甜味突出，其鲜甜味氨基酸占比突出，组成氨基酸混合液却分别表现出甜味和苦味的特征，表明多肽中鲜甜味氨基酸占比大时，有助于多肽的鲜味呈现。AHLRF溶液表现出鲜咸味突出的特征，苦味氨基酸占比达到80%，氨基酸混合液苦味突出，甜味、鲜味和咸味不明显，其苦味值是合成肽苦味值的近3 倍，合成肽的甜味和鲜味值显著高于混合液，而合成肽突出的苦味可能与苦味氨基酸占比较大，以及C-末端为疏水氨基酸苯丙氨酸有关。总之，氨基酸混合物的味觉特征表现出单个氨基酸口味叠加的特点，而多肽丰富的滋味特征与其氨基酸组成和特定空间结构相关。

结论

通过对大球盖菇酶解液进行超滤和凝胶过滤色谱分离，结合感官评价和电子舌分析，得到鲜味最强组分F3，通过RP-HPLC-MS/MS鉴定得到8 条多肽，分别为ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF、LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW，以五肽为主，分子质量在602.3176～776.3242 Da之间。8 条多肽呈味特性丰富，且兼具鲜味及其增强特性，鲜味阈值在0.30～1.33 mmol/L之间，增鲜阈值在0.53～2.43 mmol/L之间。它们与MSG的协同增鲜实验表明，除LDWDR外，其余7 条多肽对MSG溶液均有不同程度的鲜味提升作用，提升幅度为0.18%～61.12%；除DDWWR外，其余7 条多肽对MSG溶液的咸味提升了2.55%～139.56%；ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW 5 条多肽在低浓度时也表现出良好的鲜味和咸味提升效果。除AHLRF外，其余7 条合成肽的剂量-反应曲线均呈现先升高后降低的趋势，RLVDR和KPDNR的鲜味峰值质量浓度达到5 mg/mL；协同增鲜效应研究发现，合成肽质量浓度对于协同增鲜具有重要作用。此外，通过比较合成肽和其组成氨基酸混合物的呈味特性发现，氨基酸的组成、种类和空间结构均会对合成肽的味觉属性产生影响，且合成肽的呈味并不是氨基酸味觉属性的简单叠加，而是各方面因素综合影响的结果。综上所述，本研究为大球盖菇鲜味肽的开发利用及天然鲜味调味品在食品中的应用提供了理论依据。

作者简介

通信作者：

陈万超，助理研究员，上海市农业科学院食用菌研究所。2015年于上海海洋大学获硕士学位；2019年于华东理工大学获分析化学博士学位，同年于上海市农业科学院食用菌研究所加工技术与发酵工程研究室参加工作，2020年入选上海市启明星计划。

主要从事大球盖菇、猴头菇、桑黄等食药用菌深加工研究，聚焦菌物蛋白、多肽、多酚、多糖等优质营养风味和功能活性成分，开展质量品质控制和评价、作用机制解析、关键影响因素探究和高附加值产品开发等工作。现主持省部级课题1 项，与企业横线合作课题横向课题3 项，作为课题骨干参与国家省部级课题6 项，横线课题5 项。已主笔发表研究性论文28 篇，其中SCI收录15 篇，作为主要参与人申请发明专利8 项，授权3 项；授权软件著作权5 项。参与获得上海市科技进步二等奖1 项。

通信作者：

杨焱，二级研究员，硕博士生导师，国家百千万人才，国家有突出贡献的中青年专家，上海市领军人才、上海市农业领军人才；国家食用菌工程技术研究中心加工分部主任，上海市农业科学院食用菌研究所加工技术与发酵工程研究室主任；中国食用菌协会药用真菌委员会委员、中国农学会食用菌分会理事、中国菌物学会桑黄产业分会秘书长。1992年毕业于南京农业大学微生物学系，2007年毕业于江南大学食品科学学院获工学博士学位。

主要研究方向为食药同源农业资源的高值利用、食用菌营养品质和风味评价、采后加工和保鲜技术研发、营养功能食品开发。承担了国家和省市级课题50多项的，对食药用菌猴头菇和桑黄优良种源创制、发酵代谢调控、功能成分的分离制备、活性作用机制等进行了深入系统的研究，获得了高产活性代谢物的优良菌株及高值利用技术；揭示了天然活性多糖功效作用的结构基础，构建了多糖的精准质控和高效制备技术，开发了系列营养健康产品；系统研究了食用菌风味物质产生的关键因素及机制，采后加工过程感官品质和营养风味的变化规律，建立了食用菌风味评价体系。

已在国内外学术刊物上发表论文270多篇，其中SCI收录73 篇；已申请发明专利40余项，获授权32 项；负责了5 项功能食品的开发和申报，均获得国家健字号批文；认定了5 个食药用菌新品种，推广应用到全国20多个地区；与行业龙头企业合作开发了30余种系列健康食品。主持获得上海市科技进步一等奖1 项、上海市科技进步二等奖1 项、上海市技术发明三等奖；参与获得中华神农科技二等奖1 项、上海市科技进步三等奖4 项。

第一作者：