Introduction
自身免疫性肝炎（AIH）是一种由针对肝细胞的自身免疫反应所介导的肝脏实质炎症，主要病理学特征为淋巴细胞、浆细胞浸润，高免疫球蛋白和自身抗体阳性等。AIH引起的急慢性肝损伤最终可导致肝纤维化、肝癌等高风险疾病从而严重威胁人类健康。因此，进一步探讨AIH发病机制，开发具有治疗AIH作用的药物及方案具有重要意义。刀豆蛋白A（ConA）是一种刀豆提取物和植物凝集素，它作为一种高效的有丝分裂原刺激物，可在小鼠中诱导AIH，是一种成熟的模型，模拟人类发生的病理变化。
AHCC ® 是一种培养香菇菌丝体的标准提取物，它含有多种营养成分，包括各种小分子量低聚糖、多糖、氨基酸、脂质和矿物质，主要成分是
福建农林大学生命科学学院胡鑫硕士生、福建农林大学生命科学学院傅俊生教授等在本研究中通过液体发酵培养香菇菌丝体，然后经分离、冷冻干燥等生产工艺步骤，获得一种含有α-葡聚糖的香菇液体深层发酵物，并把这种含有α-葡聚糖的多糖复合物简称为FLA。同时和AHCC对比，旨在检测FLA对ConA（20 mg/kg）诱导的小鼠AIH的保护作用，研究了肝功能、组织学变化、氧化应激、炎症和凋亡标志物并证明其保肝机制。
Results and Discussion
FLA与AHCC的差异与相似
多糖作为自然界广泛分布的天然产物，其独特的生物活性通常与多糖的单糖组成、 分子质量等因素密切相关。FLA及AHCC的单糖组成分析结果见表1。表1显示，FLA主要由5种单糖组成，含量由高到低依次为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖；AHCC则主要由6种单糖组成，含量由高到低依次为葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖。从单糖含量上进一步对比分析，FLA中除葡萄糖和阿拉伯糖含量稍高于AHCC外，其余单糖含量都低于AHCC，其中AHCC的木糖、半乳糖和盐酸氨基葡萄糖分别是FLA的1.20、1.44和4.70倍，且鼠李糖为AHCC的特有单糖。进一步检测其α-葡聚糖含量，发现AHCC的葡聚糖含量是FLA的1.04倍。综上，2种多糖单糖组成种类以及含量均存在较为明显的差异。
表1 单糖组分含量及α-葡聚糖含量
图1 离子色谱图
FLA提高小鼠免疫力
在实验期间，发现随着给药天数的推移，小鼠体质量逐渐增加，并且各组之间无明显差异（图2a），表明在供试剂量下的FLA对小鼠的生长发育没有明显影响，间接提示FLA无明显毒副作用。免疫脏器指数是判断机体免疫功能强弱的初步指标，能够在一定程度上反映出脏器的损伤程度。数据表明（图2b-c），与CK组对比，AIH 模型组小鼠脾脏、胸腺指数明显上升，表明造模成功；与MC组对比，PC、FLA和AHCC组小鼠脾脏、胸腺指数均有不同程度地降低；与PC组相比，FLA、AHCC组小鼠的脾脏、胸腺指数较增加，但无明显差异，且两者更为接近。又进一步对脾和胸腺进行病理组织显微观察（图2d-e），CK组脾脏组织结构正常，红髓与白髓的结构及界限清晰，淋巴细胞密集且排列规则整齐；胸腺组织皮质髓质分界明显，皮质区淋巴细胞排列整齐，细胞形态良好，髓质区可见胸腺小体。而在MC组小鼠中，脾脏出现大量空泡，淋巴细胞稀疏紊乱，白髓与红髓分界线逐渐模糊，动脉周围淋巴鞘增生，淋巴细胞数量减少细胞排列较为疏松，红髓内的脾索大量充血；胸腺细胞数明显减少、结构疏松，细胞间隙增大，可见大量网状上皮细胞，皮质分界较为模糊。而FLA组、AHCC组和PC组中病理指标均有一定的改善减轻现象。可初步确定，FLA对治疗自身免疫性肝炎是有效的，在一定程度上能有效保护的小鼠脏器。
图2 FLA对小鼠免疫力的影响
FLA对小鼠肝功的拯救
白蛋白（ALB）是人体内最主要的蛋白，约占血清总蛋白（TP）的一半以上，肝脏是合成白蛋白的主要场所，当机体因应激或创伤等因素影响，会导致肝脏白蛋白合成减少。
与MC组相比，CK及给药组的TP、ALB的含量都高于MC组，说明FLA可以减轻ConA造成的肝损伤（见表2）。当肝组织损伤或肝细胞坏死时，酶将从肝细胞释放到血液中，血清中ALT、AST活性升高，直接反映了肝细胞损伤程度。TNF-α和IL-6是免疫细胞分泌的效应分子，免疫细胞易作用于肝脏，释放促炎因子及活性氧簇等分子，导致肝脏炎性损伤。由图3a-d可知，MC组小鼠血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6含量极显著高于CK组，表明模型组小鼠肝脏受损严重。与MC组相比，FLA组、AHCC组和PC组小鼠ALT、AST、TNF-α和IL-6含量均极显著降低，能显著性改善肝损伤，其中，PC组的各因子含量接近于空白组，FLA组的减缓效果相对弱于AHCC组，但二者之间无明显差异。由图3e的肝指数看出，与CK组相比，AIH模型组小鼠肝指数明显升高，表明造模成功；与MC组，PC、FLA和AHCC组的肝指数均有不同程度地降低，且三组之间无明显差异。进一步对肝脏组织进行HE染色镜检后发现（图2f），CK组小鼠肝细胞大小形态正常，排列整齐，边界清晰，肝组织淋巴细胞浸润少；而MC组肝组织结构紊乱，肝细胞排列紊乱、细胞肿胀破裂、细胞边界模糊、细胞核固缩，出现严重的炎细胞浸润；而给药组及PC组明显减缓小鼠肝损伤病理状态，其中，PC组肝细胞分布均匀，与CK组类似，无明显变性；FLA组小鼠肝细胞排列较为整齐，肝细胞内出现中度空泡，有少量肝细胞坏死；AHCC组大部分肝细胞清晰可见，只有少量炎细胞浸润。综上，表明FLA能有效改善肝损伤小鼠的炎症反应。
表2 小鼠血清TP、ALB、GLO含量的变化
图3 FLA对小鼠血清指标及肝脏的影响
FLA通过BAX/BCL-2通路减轻ConA诱导的细胞凋亡
通过对BAX/BCL-2通路进行定性和定量分析，结果如图4，与CK组相比，MC组促凋亡因子BAX的表达增加，经治疗后，给药组和PC组表达均下降；而抗凋亡因子BCL-2的表达下降，给药组和PC组的表达上升。同时，BAX和BCL-2的比例关系决定着细胞的存亡。凋亡蛋白BAX、BCL-2的比值结果显示，与CK组相比，MC组中BCL-2/BAX比率明显下降，促进细胞凋亡，经给药处理后，给药组及PC组的比值明显有所上升，表明在一定程度上抑制了细胞凋亡。其中，PC组的治疗效果优于AHCC组和FLA组，FLA组减轻肝细胞凋亡的作用与AHCC组接近。综上，表明FLA可在一定程度上抑制该通路的激活，减轻肝损伤。
图4 FLA对ConA诱导AIH小鼠肝脏BAX和BCL-2表达的影响
FLA通过TRAF6/NF-κB途径减弱炎症参数
NF-κB信号通路的激活失调是各种自身免疫和炎症疾病的发病机理。为了验证FLA在炎症通路中的机制作用，从转录和蛋白表达水平进行了相关分析。qPCR结果显示（图5a-e），MC组Nf-κb、Tlr4、Traf6、Il-6、Tnf-α的表达量较CK组而言，极显著升高，表明经Con A损伤后，小鼠肝组织炎症反应明显增强；与MC组相比，给药组和PC组均极显著下调该通路中相关因子的表达水平，且各组之间无明显差异。Western blot检测结果显示（图5f-h），与CK组相比，MC组NF-κB、TRAF6表达量极显著增加；与MC组相比，给药组和PC组的表达均降低；FLA和AHCC组的NF-κB、TRAF6表达量较PC组而言有所上升，FLA组增加效果要明显强于AHCC组。IHC显色结果表明，FLA、AHCC和PC组的NF-κB、IL-6、TNF-α的表达量较MC组而言，极显著的降低（图5i）。以上结果提示FLA抑制NF-κB信号通路中各转录因子的表达使炎症反应减弱，缓解小鼠肝损伤。
图5 FLA通过TRAF6/NF-kB途径改善Con A诱导的小鼠肝损伤
FLA通过NRF2途径缓解ConA诱导的小鼠氧化应激
对NRF2信号通路中的相关因子进行qPCR、Western blotting与免疫组化分析。qPCR结果显示（图6a-c），与CK组相比，MC组中Nrf2、Ho-1表达水平显著下调，而Keap-1表达量极显著上调；与MC组相比，给药组及PC组Nrf2、Ho-1表达水平逐渐上调；而Keap-1的表达水平逐渐下调，且各组之间无明显差异。Western blot检测结果显示（图6d-f），MC组NRF2、HO-1蛋白表达量较CK组而言，极显著降低；与MC组相比，FLA、AHCC和PC组可以显著升高受损肝脏组织中的NRF2、HO-1的蛋白表达；与PC组相比，AHCC组减轻肝损伤更显著，而FLA组的减缓作用较轻。IHC显色结果表明，FLA、AHCC和PC组的NRF2、HO-1的表达量较MC组而言，极显著地降低（图6g）。表明FLA可调控肝脏组织中NRF-2信号通路，来提高体内抗氧化应激能力。
图6 FLA通过Nrf2途径改善Con A诱导的小鼠肝损伤
FLA改善了AIH小鼠的回肠形态和肠道微生物群
首先对小鼠回肠进行HE染色观察（图7a），结果发现，CK组小鼠回肠绒毛呈指状突起、排列整齐致密。MC组小鼠回肠绒毛断裂变短，腺体排列松散紊乱，伴有肠绒毛上皮细胞水肿和炎症细胞浸润现象。与MC组相比，FLA、AHCC及PC组明显减缓小鼠回肠病理状态，其中，PC组腺体排列整齐，只有少许肠绒毛断裂，与CK组类似；FLA组和AHCC组小鼠回肠腺体排列较为紊乱，有少量水肿和炎性细胞浸润，但FLA组的肠绒毛脱落较严重。提示FLA可以缓解小鼠回肠病理情况。
通过检测小鼠盲肠肠道菌群的物种分布，共检测到12门，18纲，38目，62科，123属，213种微生物。由图7b可以看出，Firmicutes和Bacteroidota是主要的优势菌门，且相对丰度较高，与MC相比，FLA组的Firmicutes相对丰度增加，而Bacteroidota相对丰度减少。对小鼠肠道菌群属水平分析（图7c），与MC组相比，FLA组明显提高Lactobacillus相对丰度，且Ligilactobacillus相对丰度也高于MC组，降低了Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_Muribaculaceae相对丰度。再从种水平进一步分析小鼠肠道菌群物种变化（见图7d），与MC组相比，FLA组明显提高Lactobacillus_johnsonii、Ligilactobacillus_murinus、Lactobacillus_intestinale、Lactobacillus_acidifaciens相对丰度，降低unclassified_Muribaculaceae、unclassified_Lachnospiraceae_NK4A136_group、Muribaculum_intestinale相对丰度。因此，FLA可提高Lactobacillus_johnsonii等有益菌的相对丰度，降低unclassified_Muribaculaceae等致病菌的相对丰度。
图7 FLA对AIH小鼠回肠与肠道菌群改善作用
肠道微生物组成与肝损伤标志物的相关性
根据各个物种在不同组别的丰度变化情况，筛选相关性大于0.1并进行斯皮尔曼相关分析构建的相关性网络图（图8a），其中排名前10的分别为Lactobacillus、unclassified_Muribaculaceae、Muribaculum、Bacteroides、Candidatus_Arthromitus、Oscillibacter、unclassified_Lachnospiraceae、Roseburia、28_4和Alloprevotella。该网络图表明小鼠肠道微生物中部分有益菌与致病菌之间存在负相关性，部分有益菌与有益菌之间存在正相关性。为进一步明确小鼠肠道微生物与肝损伤之间的关系，又分析了种水平相对丰度在前10的物种与相关因子之间的关系，结果见图8b-c，Muribaculum_intestinale的相对丰度与Nrf2、Ho-1、Bcl-2呈负相关，与S IL-6、S TNF-α、S AST、S ALT、Bax、Nf-κb、Tlr4、Traf6、Il-6、Tnf-α、Keap-1呈正相关。Lactobacillus_johnsonii、Ligilactobacillus_murinus的相对丰度与S IL-6、S TNF-α、S AST、S ALT、Bax、Nf-κb、Tlr4、Traf6、Il-6、Tnf-α、Keap-1呈负相关，与Nrf2、Ho-1、Bcl-2呈正相关。综上，FLA可能通过增加Lactobacillus_johnsonii、Ligilactobacillus_murinus的相对丰度来改善小鼠的肝脏损伤。
图8 FLA对ConA诱导的小鼠回肠和肠道菌群变化的影响
Conclusion
本研究通过液体深层发酵技术得到香菇发酵复合物（FLA），并通过Con A诱导小鼠免疫性肝损伤。在AIH的治疗研究表明，从一系列生物学指标分析，FLA具有肝保护作用。FLA保护的潜在机制可能与炎症反应的减少和肠道菌群调节的改变有关。因此，本研究的结果为开发抗AIH的有效药物提供了理论依据。
第一作者
胡鑫，女，福建农林大学生命科学学院生物与医药专业硕士，主要研究方向为食用菌科学与工程，食用菌活性物质提取与理化性质研究。参与1项西藏自治区科技厅项目，在国内外发表论文5篇，其中以第一作者发表论文2篇。
通信作者
傅俊生，男，福建农林大学生命科学学院教授、博士生导师，福建省级高层次人才（C类）、福建省引进高层次人才（境外 C 类），福建农林大学金山学者青年学术新秀；福建省食用菌学会理事，福建省微生物学会药用真菌专业委员会理事，福建省生物医学工程学会理事，福建省食用菌行业协会理事，中国菌物学会桑黄产业分会理事，福建省现代农业食用菌产业技术体系岗位专家组成员，福建省食用菌产业技术创新联盟副秘书长；2011–2012 美国堪萨斯大学医学中心博士后，2012–2014 美国北卡罗莱纳农业技术州立大学博士后，2016–2017 美国北卡罗莱纳中央大学国家公派访问学者；主要从事食药用真菌资源的开发利用及其功效物质基础研究。
FermentedLentinus edodesextract containingα-glucan ameliorates concanavalin A-induced autoimmune hepatitis in mice
Xin Hu
a,b
, Dan Cheng
c
, Yingxia Zhang
c
, Po Li
c
, Xiaoping Wu
a,b
, Junsheng Fu
a,b,*
a
b
c
*Corresponding author.
Abstract
Autoimmune hepatitis (AIH) is a chronic inflammatory liver disease that threatens human health worldwide. The aim of this study was to detect the protective effect of a fermentedLentinusedodesextract containingα-glucan (FLA), in a concanavalin A (ConA)-induced AIH mouse model and to determine the underlying liver-protective mechanism. The results showed that compared with the model group, the level of proinflammatory cytokines in serum of FLA pretreated mice was significantly decreased, and the degree of inflammatory cell infiltration in liver, thymus and spleen was significantly reduced. Quantitative polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and Western blotting showed that FLA pre-treatment inhibited the ConA-induced apoptosis of hepatocytes by down-regulating the expression of BAX and up-regulating the expression of BCL-2. Further research found that FLA may improve liver injury in mice by activating NRF2 signaling pathway and inhibiting TRAF6/NF-κB signaling pathway. Thus, FLA may improve liver injury in mice by shifting gut microbial composition to reduce the release of inflammatory cytokines in the serum and prevent the necrosis of hepatocytes. Up-regulation of NRF2 signaling pathway, down-regulation of TRAF6/NF-κB signaling pathway, and an increase in the relative abundance ofLactobacillus_johnsoniiandLigilactobacillus_murinusplay a protective role in liver.
Reference:
HU X, CHENG D, ZHANG Y X, et al. FermentedLentinus edodesextract containingα-glucan ameliorates concanavalin A-induced autoimmune hepatitis in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2102-2115. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250175.
